植物组织中有机酸的提取方法比较
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目前大部分研究均是采用一种方法提取一种材料中的有机酸 , 而不同提取方法对同一种材料提取效
收稿日期 : 2005 01 11 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30270790) ; 中国博士后科学基金资助项目 (2003033494) 作者简介 : 董园园 ( 1981 ) , 硕士研究生 , E2mail: qianlicao99 @ sina1com。3 通讯作者 Corresponding author: 沈其荣 ( 1957 ) , 教
有机酸广泛存在于水果 、蔬菜中 , 其种类和含量是决定果蔬风味的重要指标 , 也是果蔬成熟度 、耐 储藏性 、加工性的重要依据 , 因此测定果蔬中有机酸的种类及含量具有重要的意义 。有机酸的测定方法 主要有 3种 , 蒸馏水直接提取法 [ 1, 2 ] , 乙醇 旋转蒸发提取法 [ 3～5 ] , 乙氰 、甲醇提取法 [ 6, 7 ] 。由于乙氰 、 甲醇成本高且有毒性 , 因此较少使用 。根系分泌物中有机酸含量的分析步骤通常采用蒸馏水提取 —冷冻 干燥 (或旋转蒸发 ) 浓缩 —溶解 —HPLC分析 [8 ] 。为了确保植物组织中有机酸的高效提取和分离 , 我们 也将此法运用于植物组织中有机酸的分析 。
11412 80%乙醇 旋转蒸发浓缩提取 (简写为醇提 , E) 参照李连朝等方法 [3 ] 。将 11411中提取液改
为 80%乙醇溶液 , 称样 、研磨 、水浴 、离心步骤同上 。番茄沉淀用 10 mL 80%乙醇溶液洗涤 2次 , 上
清液定容至 50 mL; 不结球白菜叶片沉淀用 2 mL 80%乙醇溶液洗涤 2次 , 上清液定容至 10 mL , 于旋转 蒸发仪 75 ℃蒸干 , 番茄残渣加 20 mL (不结球白菜叶片用 5 mL ) 流动相溶解 , 过 0122μm 滤膜 , 然后
进行 HPLC测定 。
11413 蒸馏水 冷冻干燥提取 (简写为水提冻干 ,
W F) 参 照 郜 红 建 等 方 法 [ 8 ] 。称 样 、研 磨 、水
浴 、离心步骤同 11411。番茄沉淀用 10 mL 蒸馏水
洗涤 2次Leabharlann , 上清液定容至 50 mL; 不结球白菜叶片
沉淀用 2 mL 蒸馏水洗涤 2 次 , 上清液定容至 10
113 样品采集
番茄 L ycopersicon escu len tum (21世纪宝粉 ) 和不结球白菜 B rassica ch inensis (南农矮脚黄 ) 采用蛭
石培养 , 浇灌 Hoagland营养液 , 以番茄第一果位成熟的大小均匀的果实和不结球白菜莲座期倒三叶为
试验材料 。
114 有机酸提取
摘要 : 以番茄果实和不结球白菜叶片为试验材料 , 用蒸馏水 (水提 ) 、80%乙醇 旋转蒸发浓缩 (醇提 ) 、蒸馏水 冷冻干 燥浓缩 (水提冻干 ) 分别提取有机酸 , 采用高效液相色谱法测定 。结果表明 : 3种提取方法下番茄果实中富马酸 、丁二 酸含量无显著性差异 , 草酸 、酒石酸 、苹果酸 、草酰乙酸含量均以水提最高 , 而丙酮酸和柠檬酸以醇提含量最高 ; 不同 提取方法对不结球白菜叶片中草酸 、酒石酸 、富马酸含量无影响 , 其他几种有机酸 (除草酰乙酸外 ) 均以水提和水提冻 干含量高于醇提 , 其中 , 水提法和水提冻干法提取丙酮酸 、苹果酸 、丁二酸的含量无显著差异 , 而柠檬酸含量以水提冻 干法最高 。综合考虑试验步骤和结果等各方面因素发现 , 蒸馏水直接提取法既能有效保证有机酸的提取量 , 又能大大简 化试验步骤 。 关键词 : 高效液相色谱 ; 植物组织 ; 果实 ; 有机酸 中图分类号 : O658 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 2030 (2005) 04 0140 04
2 结果与讨论
211 9种有机酸标准品 HPLC 分析色谱图 由图 1可见 , 用 HPLC分析法在 15 m in内同时
stan da rd s (1. 草酸 Oxalic acid; 2. 酒石酸 Tartaric acid; 3. 草酰乙酸 Oxaloacetate; 4. 丙酮酸 Pyruvate; 5. 苹果酸 Malate; 6. α2酮戊二 酸 , α2Ketoglutarate; 7. 柠 檬 酸 Citrate; 8. 富 马 酸 Fumarate; 9. 丁二酸 Succinate. The same as Fig12. )
Study on the methods of extraction organ ic ac ids from d ifferen t plan t tissue by HPLC
DONG Yuan2yuan, DONG Cai2xia, LU Ying2lin, M IAO Chen, SHEN Q i2rong3
1 试验条件与方法
111 仪器与试剂
W aters 600 2487高效液相色谱仪 , 紫外检测器 , 上海亚荣长化仪器厂 RE 52 C旋转蒸发仪 , 美 国 Sawant公司 SML 2400 s冰冻干燥机 。有机酸标准品 : 草酸 、酒石酸 、草酰乙酸 、丙酮酸 、α2酮戊二
酸 、柠檬酸 、富马酸 、丁二酸均为分析纯试剂 , 苹果酸采用 Sigma公司产品 。
mL , 于冰冻干燥机中冷冻干燥 , 番茄沉淀加 20 mL
(不结球白菜叶片用 5 mL ) 流动相溶解 , 过 0122 μm 滤膜后进行 HPLC测定 。 115 数据处理
所有数据处理均采用 SPSS2LSD 法 。
t/m in
图 1 9种有机酸混合标准品色谱图 F ig11 Chroma togram of a m ixture of 9 organ ic ac id
(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract: In this experiment, organic acids were extracted from tomato fruit and Chinese cabbage leaves by different extraction methods, such as by distilled water directly (W ) , by 80% ethanol and then evaporation for concentration ( E) , and by distilled water for extraction and then frozen2evaporation concentration (W F) and then determ inated by HPLC. The results obtained are lis2 ted as follows. In term s of tomato fruits, the extracted amounts of fumarate and succinate were not influenced by extraction meth2 ods, while the amounts of oxalic acid, tartaric acid, malate and oxaloacetate extracted by W method were significantly higher than those extracted by the other two methods. E method could extract the highest amount of pyruvate and citrate. For Chinese cabbage leaves, no significant differences were found in oxalic acid, tartaric acid and fumarate extracted by the three extraction methods, whereas the amount of the other organic acids ( excep t for oxaloacetate) extracted by W and W F method were significantly higher than those extracted by E method. There were no significant difference of pyruvate, malate, and succinate extracted byW and W F method while citrate amount extracted by W F was higher than that by W. Therefore, distilled water extraction (W ) method was p roposed to extract organic acids from tomato fruits and Chinese cabbage leaves when taking the extraction step s, working efficiency and extraction quality together into account. Key words: HPLC; p lant tissue; fruit; organic acids
中 , 加入 3 mL 蒸馏水和少许石英砂 , 研磨成匀浆 , 移入 10 mL离心管中 , 再用 1 mL 蒸馏水洗涤研钵 2
次并转移至离心管 , 总体积为 5 mL , 于 75 ℃水浴中提取 15 m in; 以 20 000 r·m in- 1离心 20 m in, 上清 液过 0122μm 滤膜后进行 HPLC测定 。
112 色谱条件
色谱柱 : 德国 M erck公司生产的 H ibar colum n RT 250 mm ×416 mm C18柱 , 填料直径 5 μm , 柱温 30 ℃, 流动相为 015% (NH4 ) 2 HPO4 2H3 PO4 (pH 215) 缓冲液 , 使用前用 0145 μm 滤膜抽滤 , 流速为 1 mL ·m in- 1 , 紫外检测波长 214 nm , 进样量 20μL。
南京农业大学学报 2005, 28 (4) : 140～143 Jou rna l of N an jing A g ricu ltu ra l U n iversity
植物组织中有机酸的提取方法比较
董园园 , 董彩霞 , 卢颖林 , 缪辰 , 沈其荣 3
(南京农业大学资源与环境科学学院 , 江苏 南京 210095)
授 , 从事植物氮素营养研究 , Tel: 025 84395212, E2mail: qrshen@ njau1edu1cn。
第 4期 董园园等 : 植物组织中有机酸的提取方法比较
·141·
果的比较分析较少 。不同的试验材料 , 如植物的果实和叶片 , 由于组织结构和物质种类的差异 , 不同的 提取剂和提取方法所能提取到的有机酸量会相差很大 。因此 , 本研究用不同提取方法对不同植株器官有 机酸的提取进行比较 , 以期能寻找到一条既能一次性提取多种有机酸又能简化试验步骤提高工作效率的 途径 。
11411 蒸馏水直接提取 (简写为水提 , W ) 参照沈宏等方法 [9 ] 。番茄果实约 20 g用打浆机打碎 , 准
确称取匀浆后的番茄 5100 g, 加入 20 mL 蒸馏水 , 于 75 ℃水浴中提取 15 m in; 以 20 000 r·m in- 1离心 20 m in, 上清液过 0122μm 滤膜后进行 HPLC测定 。称取剪碎混匀的不结球白菜叶片 2150 g置于研钵
收稿日期 : 2005 01 11 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30270790) ; 中国博士后科学基金资助项目 (2003033494) 作者简介 : 董园园 ( 1981 ) , 硕士研究生 , E2mail: qianlicao99 @ sina1com。3 通讯作者 Corresponding author: 沈其荣 ( 1957 ) , 教
有机酸广泛存在于水果 、蔬菜中 , 其种类和含量是决定果蔬风味的重要指标 , 也是果蔬成熟度 、耐 储藏性 、加工性的重要依据 , 因此测定果蔬中有机酸的种类及含量具有重要的意义 。有机酸的测定方法 主要有 3种 , 蒸馏水直接提取法 [ 1, 2 ] , 乙醇 旋转蒸发提取法 [ 3～5 ] , 乙氰 、甲醇提取法 [ 6, 7 ] 。由于乙氰 、 甲醇成本高且有毒性 , 因此较少使用 。根系分泌物中有机酸含量的分析步骤通常采用蒸馏水提取 —冷冻 干燥 (或旋转蒸发 ) 浓缩 —溶解 —HPLC分析 [8 ] 。为了确保植物组织中有机酸的高效提取和分离 , 我们 也将此法运用于植物组织中有机酸的分析 。
11412 80%乙醇 旋转蒸发浓缩提取 (简写为醇提 , E) 参照李连朝等方法 [3 ] 。将 11411中提取液改
为 80%乙醇溶液 , 称样 、研磨 、水浴 、离心步骤同上 。番茄沉淀用 10 mL 80%乙醇溶液洗涤 2次 , 上
清液定容至 50 mL; 不结球白菜叶片沉淀用 2 mL 80%乙醇溶液洗涤 2次 , 上清液定容至 10 mL , 于旋转 蒸发仪 75 ℃蒸干 , 番茄残渣加 20 mL (不结球白菜叶片用 5 mL ) 流动相溶解 , 过 0122μm 滤膜 , 然后
进行 HPLC测定 。
11413 蒸馏水 冷冻干燥提取 (简写为水提冻干 ,
W F) 参 照 郜 红 建 等 方 法 [ 8 ] 。称 样 、研 磨 、水
浴 、离心步骤同 11411。番茄沉淀用 10 mL 蒸馏水
洗涤 2次Leabharlann , 上清液定容至 50 mL; 不结球白菜叶片
沉淀用 2 mL 蒸馏水洗涤 2 次 , 上清液定容至 10
113 样品采集
番茄 L ycopersicon escu len tum (21世纪宝粉 ) 和不结球白菜 B rassica ch inensis (南农矮脚黄 ) 采用蛭
石培养 , 浇灌 Hoagland营养液 , 以番茄第一果位成熟的大小均匀的果实和不结球白菜莲座期倒三叶为
试验材料 。
114 有机酸提取
摘要 : 以番茄果实和不结球白菜叶片为试验材料 , 用蒸馏水 (水提 ) 、80%乙醇 旋转蒸发浓缩 (醇提 ) 、蒸馏水 冷冻干 燥浓缩 (水提冻干 ) 分别提取有机酸 , 采用高效液相色谱法测定 。结果表明 : 3种提取方法下番茄果实中富马酸 、丁二 酸含量无显著性差异 , 草酸 、酒石酸 、苹果酸 、草酰乙酸含量均以水提最高 , 而丙酮酸和柠檬酸以醇提含量最高 ; 不同 提取方法对不结球白菜叶片中草酸 、酒石酸 、富马酸含量无影响 , 其他几种有机酸 (除草酰乙酸外 ) 均以水提和水提冻 干含量高于醇提 , 其中 , 水提法和水提冻干法提取丙酮酸 、苹果酸 、丁二酸的含量无显著差异 , 而柠檬酸含量以水提冻 干法最高 。综合考虑试验步骤和结果等各方面因素发现 , 蒸馏水直接提取法既能有效保证有机酸的提取量 , 又能大大简 化试验步骤 。 关键词 : 高效液相色谱 ; 植物组织 ; 果实 ; 有机酸 中图分类号 : O658 文献标识码 : A 文章编号 : 1000 2030 (2005) 04 0140 04
2 结果与讨论
211 9种有机酸标准品 HPLC 分析色谱图 由图 1可见 , 用 HPLC分析法在 15 m in内同时
stan da rd s (1. 草酸 Oxalic acid; 2. 酒石酸 Tartaric acid; 3. 草酰乙酸 Oxaloacetate; 4. 丙酮酸 Pyruvate; 5. 苹果酸 Malate; 6. α2酮戊二 酸 , α2Ketoglutarate; 7. 柠 檬 酸 Citrate; 8. 富 马 酸 Fumarate; 9. 丁二酸 Succinate. The same as Fig12. )
Study on the methods of extraction organ ic ac ids from d ifferen t plan t tissue by HPLC
DONG Yuan2yuan, DONG Cai2xia, LU Ying2lin, M IAO Chen, SHEN Q i2rong3
1 试验条件与方法
111 仪器与试剂
W aters 600 2487高效液相色谱仪 , 紫外检测器 , 上海亚荣长化仪器厂 RE 52 C旋转蒸发仪 , 美 国 Sawant公司 SML 2400 s冰冻干燥机 。有机酸标准品 : 草酸 、酒石酸 、草酰乙酸 、丙酮酸 、α2酮戊二
酸 、柠檬酸 、富马酸 、丁二酸均为分析纯试剂 , 苹果酸采用 Sigma公司产品 。
mL , 于冰冻干燥机中冷冻干燥 , 番茄沉淀加 20 mL
(不结球白菜叶片用 5 mL ) 流动相溶解 , 过 0122 μm 滤膜后进行 HPLC测定 。 115 数据处理
所有数据处理均采用 SPSS2LSD 法 。
t/m in
图 1 9种有机酸混合标准品色谱图 F ig11 Chroma togram of a m ixture of 9 organ ic ac id
(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)
Abstract: In this experiment, organic acids were extracted from tomato fruit and Chinese cabbage leaves by different extraction methods, such as by distilled water directly (W ) , by 80% ethanol and then evaporation for concentration ( E) , and by distilled water for extraction and then frozen2evaporation concentration (W F) and then determ inated by HPLC. The results obtained are lis2 ted as follows. In term s of tomato fruits, the extracted amounts of fumarate and succinate were not influenced by extraction meth2 ods, while the amounts of oxalic acid, tartaric acid, malate and oxaloacetate extracted by W method were significantly higher than those extracted by the other two methods. E method could extract the highest amount of pyruvate and citrate. For Chinese cabbage leaves, no significant differences were found in oxalic acid, tartaric acid and fumarate extracted by the three extraction methods, whereas the amount of the other organic acids ( excep t for oxaloacetate) extracted by W and W F method were significantly higher than those extracted by E method. There were no significant difference of pyruvate, malate, and succinate extracted byW and W F method while citrate amount extracted by W F was higher than that by W. Therefore, distilled water extraction (W ) method was p roposed to extract organic acids from tomato fruits and Chinese cabbage leaves when taking the extraction step s, working efficiency and extraction quality together into account. Key words: HPLC; p lant tissue; fruit; organic acids
中 , 加入 3 mL 蒸馏水和少许石英砂 , 研磨成匀浆 , 移入 10 mL离心管中 , 再用 1 mL 蒸馏水洗涤研钵 2
次并转移至离心管 , 总体积为 5 mL , 于 75 ℃水浴中提取 15 m in; 以 20 000 r·m in- 1离心 20 m in, 上清 液过 0122μm 滤膜后进行 HPLC测定 。
112 色谱条件
色谱柱 : 德国 M erck公司生产的 H ibar colum n RT 250 mm ×416 mm C18柱 , 填料直径 5 μm , 柱温 30 ℃, 流动相为 015% (NH4 ) 2 HPO4 2H3 PO4 (pH 215) 缓冲液 , 使用前用 0145 μm 滤膜抽滤 , 流速为 1 mL ·m in- 1 , 紫外检测波长 214 nm , 进样量 20μL。
南京农业大学学报 2005, 28 (4) : 140～143 Jou rna l of N an jing A g ricu ltu ra l U n iversity
植物组织中有机酸的提取方法比较
董园园 , 董彩霞 , 卢颖林 , 缪辰 , 沈其荣 3
(南京农业大学资源与环境科学学院 , 江苏 南京 210095)
授 , 从事植物氮素营养研究 , Tel: 025 84395212, E2mail: qrshen@ njau1edu1cn。
第 4期 董园园等 : 植物组织中有机酸的提取方法比较
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果的比较分析较少 。不同的试验材料 , 如植物的果实和叶片 , 由于组织结构和物质种类的差异 , 不同的 提取剂和提取方法所能提取到的有机酸量会相差很大 。因此 , 本研究用不同提取方法对不同植株器官有 机酸的提取进行比较 , 以期能寻找到一条既能一次性提取多种有机酸又能简化试验步骤提高工作效率的 途径 。
11411 蒸馏水直接提取 (简写为水提 , W ) 参照沈宏等方法 [9 ] 。番茄果实约 20 g用打浆机打碎 , 准
确称取匀浆后的番茄 5100 g, 加入 20 mL 蒸馏水 , 于 75 ℃水浴中提取 15 m in; 以 20 000 r·m in- 1离心 20 m in, 上清液过 0122μm 滤膜后进行 HPLC测定 。称取剪碎混匀的不结球白菜叶片 2150 g置于研钵