氮自由基（DPPH）清除

氮⾃由基（DPPH）清除
⼀．实验原理：DPPH（11-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即11-⼆苯基-2-苦基肼基⾃由基，DPPH⾃由基是⼀种较稳定的含氮⾃由基，有⼀个单电⼦，在517nm下有强吸收，如果
有其他物质提供⼀个电⼦使此单电⼦配对，其吸收会消失褪⾊，褪⾊程度与接受电⼦的量呈
正⽐。

即反应物清除氮⾃由基的能⼒与试剂在517nm的吸光值成反⽐。

⼆．实验仪器：分光光度计
三．实验试剂：试剂⼀：DPPH试剂1mL×1瓶
试剂⼆：100µg/mL 维⽣素C标准溶液 20mL×1瓶
四．溶液配制：
试剂⼀：37℃平衡20min以上，待试剂融化后，在试剂瓶中加⼊100ml 95%⼄醇或⽆⽔⼄醇，剧烈震荡使试剂充分溶解。

注意：溶解⼀定要充分，如有条件可采⽤超声波助溶。

试剂⼆应⽤液：根据是否需要制作阳性对照标准曲线有两种配制⽅法。

1. 如仅需要将维⽣素C作为质控品，可取100µL 试剂⼆，加⼊900µL样品稀释液，充分混匀；
2. 如需测定维⽣素C的IC50，可分别移取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，
3.0，
4.0，
5.0mL 试
剂⼆于空离⼼管中，再依次加⼊10.0，9.5，9.0，8.5，8，7.5，7.0，6.0，5.0ml样品稀释液，充分混匀。

配制成
0，5，10，15，20，25，30，40，50 µg/mL 维⽣素C样品。

五．实验步骤:
六．清除能⼒计算：
氮(DPPH)⾃由基清除清除能⼒(%)=[空⽩孔吸光值-(测定孔吸光值-对照孔吸光值)]/空⽩孔吸光值*100%
七．注意事项：
1. 如样品中⾊素物质不是分析对象，建议先通过SEP C18柱进⾏脱⾊处理，处理后样品可不
做对照孔；
2. 如不确定样品的氮⾃由基清除能⼒，可先做不同浓度的稀释液进⾏摸索，并选择适宜浓度
进⾏测定，⾼浓度下，浓度与清除率间并不线性相关。