中译名非甾体类抗炎药环氧合酶多药...

刘军：环氧冶－酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
英文缩写
ＮＳＡ【Ｄ
ＣＯＸ
Ｍ１３ｌＲ
Ｐ—ｇｐ
ＶＣＲ
ＡＤＭ
５．ＦＵ
ＭＭＣ
ＤＤＰ
ＤＡＢ
ＭＴＴ
ＤＭＳＯ
ＩＣ５０
ＯＤ
ＰＢＳ
ＰＧ
ＳＰ
ＦＡＣｓ
英文缩略词表
英文全名
ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｎｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇ
ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ
ｍｕｌｆｌｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
Ｐ—ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ
ｖｉｎｅｒｉｓｔｉｎｅ
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ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ－Ｃ
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ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ—ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
中译名
非甾体类抗炎药
环氧合酶
多药耐药
Ｐ一糖蛋白
长春新碱
阿霉素
氟脲嘧啶
丝列霉素
顺铂
３，３’一二氛基联苯胺
噻唑蓝
二甲基亚砜
半数抑制剂量
光密度
磷酸盐缓冲生理盐水
前列腺素
链酶卵白素一过氧化物酶
流式细胞仪
扬州大学硕士论文
环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
摘要
背景：
在我国，胃癌是发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，预后极差。

多药耐药（ＭＤＲ）的形成是胃癌难治与复发的生物学基础，寻找肿瘤耐药的形成机制及有效的逆转药物是肿瘤研究领域的一项重要课题。

近十余年来，人们发现以阿斯匹林为代表的非甾体类消炎药（ＮｓＡⅢｓ）在肿瘤，尤其是消化道肿瘤的预防与治疗中具有明显的作用，其机制可能与抑制环氧合酶－２（ＣＯＸ－２）合成有关。

环氧合酶（ｃｏｘｌ是前列腺素类合成的限速酶，已有多项研究证实其亚型ＣＯＸ．２通过多种途径参与消化道肿瘤的形成。

目前发现ＣＯＸ一２还可能与肿瘤多药耐药有关，从而进一步丰富了ＣＯＸ－２与肿瘤相关的证据，为肿瘤的防治开辟了一条崭新途径。

目的：
本实验旨在通过测定ＣＯＸ一２在胃癌组织中的表达，并观察其与Ｐ－印表达相关性。

同时在细胞水平观测ＣＯＸ一２抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对多药耐药的逆转及Ｐ—ｇｐ的调变作用。

探讨ＣＯＸ一２与胃癌的关系及ＣＯＸ．２对胃癌细胞ＭＤＲ调节作用。

材料与方法：
１．观察胃癌组（手术标本）和正常对照组（胃镜下胃粘膜组织），采用免疫组织化学方法，测定各组ＣＯＸ一２，ｐ－ｇＰ的表达率以及在肿瘤细胞中的分布情况。

２．以长春新碱（ｖｃＲ）诱导的人胃癌多药耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ为研究对象，应用流式细胞术，ＭＴＴ法及免疫细胞化学方法研究ＣＯＸ一２抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对耐药性的逆转作用及可能的机制
结果：
１．ＣＯＸ一２在胃癌组织中高表达，阳性率为６０．４％。

ＣＯＸ一２阳性组中ｐ－ｇＰ表达阳性率为８２．８％，ＣＯＸ一２阴性组Ｐ—ｇｐ同时阴性６３．２％，两者有高度正相关性，相关系数ｒ＝０．４７０（Ｐ＜Ｏ．０１）。

２．ＭＴＴ显示体外Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ明显抑制ＳＧＣ７９０１、ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的生长，
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
并呈时间、剂量依赖性。

经非细胞毒剂量（２．５ｕｍｏｌ／１）的Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用后，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的多药耐药性得到部分逆转，表现为靶细胞对多种化疗药物的敏感性显著增加，逆转倍数为１．０９．６．２８；流式细胞仪分析发现，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ介导的ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞耐药性的逆转伴有胞内阿霉素浓度的升高；免疫细胞化学研究显示，经Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用后耐药株ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ表达Ｐ—ｇｐ强度下降。

结论：
１．ＣＯＸ－２的表达参与胃癌的发生及恶性进展，并可能干预Ｐ—ｇｐ表达参与对肿瘤的多药耐药（ＭＤＲ）作用。

２．Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ能有效的抑制肿瘤细胞的生长，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ能部分逆转ＳＧＣ７９０１ＮＣＲ细胞的多药耐药性，其可能主要通过影响Ｐ．ｇｐ蛋白的药物泵功能实现。

【关键词】胃癌；环氧合酶一２；多药耐药
扬州大学硕士论文４ＳｔｕｄｙｏｎＴｈｅＣｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２ＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＭｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＧａｓｔｒｉｃＣａｒｃｉｎｏｍａ
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：
Ｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｈａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｒａｐｉｄｌｙ．Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｉｓｄｅｐｒｅｓｓｉｎｇｗｉｔｈ５－ｙｒｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｌｅｓｓｔｈａｎ１５－２０％．Ｍｕｌｔｉ—ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ）ｉｓｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｂａｓｉｓｏｆｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｇａｓｌｒｉｃｃａｎｃｅｒ．ＳｅａｒｃｈｉｎｇｆｏｒａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｒｅｖｅｒｓｉｎｇａｇｅｎｔｏｆＭＤＲｉｓａｌｗａｙｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｌｙｔｅｎｙｅａｒｓ，ｓｏｍｅｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌａｎｔｉ—ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｄｒｕｇｓ（ＮＡＳＡＩＤｓ）ｃｏｕｌｄｒｅｄｕｃｅｔｈｅｒｉｓｋｏｆｃａｎｃｅｒ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｏｎｅｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙｉｓｔｈａｔＮＳＡｌＤｓｉｎｈｉｂｉｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ·２（ｃｏｘ·２）．Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ｃｏｘ）ｉｓｔｈｅｒａｔｅ—ｌｉｍｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅｆｏｒｔｈｅｈｉｇｈｏｕｔｐｕｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓｆｒｏｍａｒａｃｈｉｄｏｎｉｃａｃｉｄ．ＭａｎｙｆｉｎｄｉｎｇｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｉｓｏｆｏｒｍａｔｅＣＯＸ－２ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｍａｎｙｗａｙｓ，ＲｅｃｅｎｔｌｙｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＣＯＸ－２ｍａｙｒｅｌａｔｅｔｏＭＤＲ，ｉｔｗｉｌｌｎｏｔｏｎｌｙｅｎｒｉｃｈｔｈｅｅｖｉｄｅｎｃｅｔｈａｔＣＯＸ．２ｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｗｉｔｈｃａｎｃｅｒ，ｂｕｔａｌｓｏｂｅａｎｅｗｔａｒｇｅｔｆｏｒｃａｎｃｅｒｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：
Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ－２（ＣＯＸ一２）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＯＸ－２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎＰ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｅｔｏｏｋｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌｓａｓｔａｒｇｅｔｓｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＯＸ一２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐａｒｔｉａｌｒｅｖｅｒｓｉｎｇｅｆｆｅｃｔｕｐｏｎＭＤＲｏｆｃａｎｃｅｒａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．ＴｏｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｒｏｌｅｏｆＣＯＸ－２ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄＣＯＸ．２ｔａｋｅｐａｒｔｉｎｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ（ＭＤＲ）ｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．
Ｍｅ血ｏｄ：
１．ＵｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣＯＸ·２ａｎｄｐ－ｇＰｉｎｓｐｅｃｉｍｅｎｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ
ａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｉｎｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃｂｉｏｐｓｉｅｓ．
２．Ｔａｋｅｉｎｇｈｕｍａｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｔｌｉｎｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｏｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ（ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ）ａｓ
ｔａｒｇｅｔｓｔｏ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅＣＯＸ一２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＰａｒｔｉａｌｒｅｖｅｒｓｅｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｎｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｏｆＳＧＣ７９０１／ＶＣＲａｎｄ
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究５ｍｅｃｈａｎｉｓｍｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＭＴＴａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．
Ｒｅｓｕｌｔ
１．ＴｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｏｆＣＯＸ－２ｗａｓ６０．４％ｈｉｇｈｅｒｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．ｗｅｆｉｎｄｔｈａｔＰ－ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｉｎＣＯＸ－２ｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐＷａｓ８２．８％．ａｎｄ６３．２％ｏｆＰ·ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎＷａＳｎｏｔｅｘｐｒｅｓｓｉｎＣＯＸ－２ｎｅｇａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＣＯＸ－２ＷａＳｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＰ－ｇｌｙｃｏｐｍｔｅｉｎ．ＴｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔＷａＳｒ＝Ｏ．４７０ｆＰ＜ｏ．０１）．
２．ＭＴＴａｎａｌｙｚｅｄｔｈａｔｃｅｌｅｃｏｘｉｂＷａｓａｂｌｅｔｏｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆＳＧＣ７９０１、ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓｉｎａｄｏｓｅ－ａｎｄｔｉｍｅ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍａｎｎｅｒｉｎｖｉｔｒｏ；ＡｌｌｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｏｆＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓｗｉｔｈｎｏｎ—ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｄｏｓｅｏｆｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１），ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｔａｒｇｅｔｃｅｌｌｓｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌａｇｅｎｔｓＷａＳｒｅｍａｒｋａｂｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅＭＤＲｏｆＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓＷａｓｐａｒｔｌｙｒｅｖｅｒｓｅｄ．Ｔｈｅｒｅｖｅｒｓａｌｔｉｍｅｓｖａｒｉｅｄｆｒｏｍ１．０９ｔｏ６．２８；Ｗｉｔｈｔｈｅｈｅｌｐｏｆｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＷｅｆｏｕｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｉｌｌｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆａｄｒｉａｍｙｃｉｎｉｎＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓｄｕｒｉｎｇｃｅｌｅｃｏｘｉｂｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｖｅｒｓｅｏｆＭＤＲ．Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｈｏｗｅｄｏｖｅｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰ—ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｉｎＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓＷａＳｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｔｈｅｃｅｌｅｃｏｘｉｂ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
１．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ－２ｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ
ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｍｉｇｈｔｔａｋｅｐａｒｔｉｎｍｅｄｉａｔｉｏｎｏｆＭＤＲｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．
２．ＣｅｌｅｃｏｘｉｂＷａｓａｂｌｅｔｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｔｕｍｏｒｃｅｌｌｓ，ａｎｄｉｔＣａｎｐａｒｔｌｙｒｅｖｅｒｓｅＭＤＲｏｆＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｔｈｅＰ１７０ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＧａＳｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ；Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ一２；Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（ＭＤＲ）
扬州大学硕士论文
月ｌＪ昂
在我国，胃癌是发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一，预后差，五年生存率仅为１５—２０％。

大量研究发现即使进行根治性切除术后，五年生存率也仅为３０—５５％，大多数最终死于复发和转移，因此对胃癌尤其是进展期胃癌术后进行辅助性化疗，是消灭微转移灶，改善预后的主要手段。

但由于肿瘤细胞多药耐药性（Ｍｕｌｔｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＭＤＲ）的产生，化疗疗效往往不佳，是肿瘤治疗中最常见和急待解决的问题。

近十余年来，人们发现以阿斯匹林为代表的ＮＳＡＩＤｓ在肿瘤，尤其是消化道肿瘤的预防与治疗中具有明显的作用。

流行病学、临床治疗、动物实验等多方面资料均证实其应用有可能预防或逆转肿瘤发生。

对这一现象的研究不但深化了人们对肿瘤发病机理的认识，而且为肿瘤的防治开辟了一条崭新途径。

ＮＳＡＩＤｓ防治肿瘤的可能机理之一是通过抑制环氧合酶这一前列腺素类物质合成的关键酶，使前列腺素类物质生成减少。

在哺乳类，环氧合酶有两个亚型，ＣＯＸ－１和ＣＯＸ－２。

其中ＣＯＸ．２在正常组织细胞中多不表达或低表达，但在炎症、肿瘤等情况下，细胞受诱导而大量表达ＣＯＸ一２。

研究发现ＣＯＸ．２表达与肿瘤发生有密切关系：在多数胃癌、结肠癌组织及细胞系中ＣＯＸ一２异常高表达；而使用ＣＯＸ一２抑制剂可使肿瘤增殖受抑制，在体外实验中，ＡＰＣ基因缺失的鼠模型中ＣＯＸ－２基因的突变失活引起显著的肠息肉数目减少，体积缩小。

提示ＣＯＸ．２过表达可能是促进肿瘤发生、发展的原因之一。

近来研究发现ＣＯＸ一２可能与肿瘤多药耐药有关，有研究丝裂霉素作用后细胞内ＣＯＸ．２表达增加，而ＣＯＸ．２选择性抑制剂处理后则显著增强丝裂霉素诱导的胃癌细胞凋亡，该研究提示化疗药物可能通过增加ＣＯＸ．２的表达，减弱了自身对胃癌细胞的凋亡诱导效应，并进而可能导致肿瘤细胞对化疗的多药耐药性。

临床治疗中亦发现，ＣＯＸ．２抑制剂与５－ＦＵ，ＡＤＭ等化疗药合用，可明显提高胃癌对化疗药物的敏感性，提示ＣＯＸ．２抑制剂可能对化疗药物具有增敏作用。

也曾有人报道通过腺病毒将ＣＯＸ一２ｃＤＮＡ转导到鼠肾小球系膜细胞后，观察到ＣＯＸ－２表达增高的同时，Ｐ．印表达水平亦增加，并且可被
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
ＣＯＸ－２阻断剂ＮＳ．３９８所抑制。

ＣＯＸ一２与肿瘤多药耐药的关系目前报道很少，有待更多研究支持。

因此，本实验通过免疫组化测定ＣＯＸ一２在胃癌组织中的表达，并观察其与Ｐ．ｇｐ表达相关性。

以长春新碱（ＶＣＲ）诱导的人胃癌多药耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ为研究对象，应用流式细胞术，ＭＴＴ法及免疫细胞化学方法初步探讨ＣＯＸ．２抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对耐药性的逆转作用及其可能的机制，探讨环氧合酶．２与胃癌细胞多药耐药性相关性，并为ＣＯＸ一２抑制剂作为ＭＤＲ逆转剂在临床上应用于胃癌治疗奠定基础。

胃癌标本
ｌ
，
免疫组化测定
ＣＯＸ－２Ｐ·ｇＰ
初步判定
两者的相关性技术路线
ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ
胃癌耐药细胞株
Ｃｏｘ－２抑制剂
Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ
Ｃｏｘ－２抑制剂对胃癌细胞多耐药性影响
数据分析，分析ＣＯＸ一２对胃癌细胞多药耐药Ｊ『生调节作用●●◆
扬州大学硕士论文
第一部分胃癌组织中ＣＯＸ一２与Ｐ－ｇｐ的表达
及其与生物学行为关系的研究
材料和方法
一．组织标本及病理资料
本组４８例胃癌，为扬州大学附属医院２００２～２００３年间临床资料完整的手术切除病例，其中男性３１例，女性１７例。

年龄２８～７１岁，中位年龄５６岁。

所有患者术前均未经化疗及放疗，胃癌标本为１０％中性福尔马林固定、石腊包埋的存档组织块，ＨＥ染色进行病理诊断、分类。

所有石蜡标本经４ｕｍ厚度均连续切片，进行免疫组织化学染色。

对照组ｌＯ例源于胃镜检查组织学相对正常者，男性７例，女性３例，年龄１７～３９岁的胃黏膜组织作为正常对照。

二．免疫组化
１．主要试剂
（Ｉ）ＳＣ－１７４６山羊抗人ＣＯＸ一２多克隆抗体克隆系Ｎ．２０（美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司产品１
（２）ＺＭ０１８９鼠抗人多药耐药基因单克隆抗体即用型（Ｐ—ｇｐ／ＭＤＲｌ）克隆系ＪＳＢ一１
（３）封闭用正常山羊血清工作液和兔血清封闭液
（４）生物素标记二抗工作液
ＳＰ９０００通用型：生物素标记羊抗兔或鼠ｋＧ
ＳＰ９００３通用型：生物素标记兔抗羊ＩｇＧ
（５）过氧化物酶标记链霉卵白素工作液。

（６）ＤＡＢ显色液
以上试剂均购于北京中山生物技术公司
２．免疫组化方法及阴性对照设簧：
ＳＰ（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）法即过氧化酶标记的链霉素卵白素染色法，该方法由美国ＺＹＭＥＤ公司于１９８６年首建，链霉卵白索的分子量是６０Ｋｄａ，有四个亚基
刘军：环氧合ｔ，－２与胃癌多药耐药相关性的实骀研究
可和生物素结合。

该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰等优点。

本实验用正常山羊血清取代一抗作阴性对照，用已知阳性片做阳性对照。

３．免疫组化步骤：
（１）４ｕｒｎ连续石蜡切片，贴附于经防脱片剂ＡＰＥＳ处理的洁净载玻片，置于６０。

Ｃ烤箱中烤３小时；
（２）石蜡切片脱蜡至水；
（３）３％过氧化氢孵育５分钟，消除内源性过氧化物酶的活性；
（４）蒸馏水冲洗，ＰＢＳ浸泡５分钟，在ＰＨ６．０的１０ｍＭ枸橼酸钠缓冲液中，微波７５０Ｗ加热１０分钟，
（５）１０％兔／山羊血清封闭１０分钟；
（６）清去血清，勿洗，加入不同的一抗（ｃｏｘ一２／ｐ－ｇＰ），另取用正常山羊血清取代一抗作阴性对照。

４＂Ｃ过夜；
（７）ＰＢＳ洗５分钟×３次，滴加生物素标记的二抗，３７。

Ｃ孵育３０分钟；
（８）ＰＢＳ洗３分钟Ｘ３次，滴加过氧化物酶标记的链霉卵白素３７＂Ｃ孵育３０分钟；（９）ＰＢＳ洗３分钟×３次，ＤＡＢ显色，显微镜下观察控制反应时间，终止显色：（１０）苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

４．免疫组化结果判断和评价：
结果判定：Ｐ唱Ｐ主要表达在肿瘤细胞的细胞质或细胞膜上，出现棕黄色颗粒（图１），ＣＯＸ一２蛋白表达阳性为细胞质出现棕黄色颗粒者（图２）。

每张切片由２名医师双盲观测１０个高倍（１０×４０）视野。

结果以阳性细胞所占百分比表示，即光镜下（×４０）随机选取ｌＯ个视野，每个视野计数１００个细胞，取其均值，口Ｅｌ＇陛细胞数＜２０％为阴性（一），２０％以上阳性（＋）。

三统计方法：采用Ｘ２检验及Ｓｐｅａｒｍａｎ’Ｓ等级相关校正公式分析相关性
扬州犬学硕士论文图】－１胃癌组织ＣＯＸ－２表达阳性ｓＰ法（×２００）
Ｆｉｇ１－１ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＯＸ－２ｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｇａｎｇｅｒｔｉｓｓｕｅ（ｓｐｘ２００）
图１－２胃癌组织ｐ－髓表达阳性ＳＰ＃酞×２００）
Ｆｉｇｌ－２ｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇＰｉｎｔｈｅｇａｓｔｒｉｃｃａ自ｌｃｅｒｔｉｓｓｕｅｒＳＰ×２００）
１２
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
讨论
一．ＣＯＸ．２的表达参与胃癌的发生及恶性进展
环氧合酶是前列腺素合成过程中的一个重要限速酶，目前发现其主要存在两种亚型：ＣＯＸ一１和ＣＯＸ一２。

近年来研究发现ＣＯＸ一２与肿瘤关系密切，其不仅在肿瘤中有较高表达，并可能参与肿瘤的增殖、转移及分化。

正常情况下，绝大部分组织细胞ＣＯＸ．２基因不表达，只有在细胞外广泛的刺激物作用下才诱导表达，如许多炎性细胞因子、生长因子和各种促癌因素等均可诱导体内组织产生ＣＯＸ一２。

ＣＯＸ．２能够促进肿瘤新生血管的形成，维持肿瘤组织的生长，并上调基质金属蛋白酶的表达，促进肿瘤侵袭和转移‘１～。

ｓｈｅｅｈａｎ等‘５１的研究显示，ＣＯＸ一２的表达与结、直肠癌的Ｄｕｋｅｓ分期及淋巴结转移相关。

胃癌组织中ＣＯＸ一２ｍＲＮＡ表达水平显著高于正常胃粘膜组织Ｉ矾。

我们的研究显示，ＣＯＸ一２在胃癌中的表达显著高于正常组织，其表达阳性率与胃癌的ＴＮＭ分期及淋巴结转移相关，提示ＣＯＸ．２参与了胃癌的发生、发展过程，ＣＯＸ一２的检测有助于评价胃癌的生物学行为。

二．ＣＯＸ－２可能参与对肿瘤ＭＤＲ的调节作用
ＣＯＸ．２从多个环节参与肿瘤形成，包括异型、凋亡、肿瘤血管生成、免疫功能及肿瘤侵袭等。

这些肿瘤形成机制近年来受到了极大关注，与此同时ＣＯＸ．２尚参与肿瘤形成的其他重要机制，近来推测ＣＯｘ．２可能具有调节ＭＤＲ的作用。

ｍｄｒ、／Ｐ—ｇＰ（ｍｄｒｌ指基因及信使ＲＮＡ，Ｐ—ｇＰ是基因的产物，是一种膜蛋白）对化疗药物起到外排泵的作用，并导致多药耐药。

Ｈｓｕｅｈ报道【４］丝裂霉素作用后细胞内ｃＯｘ一２表达增加，而ＣＯＸ．２选择性抑制剂ＮＳ一３９８处理后则显著增强丝裂霉素诱导的胃癌细胞凋亡，该研究提示化疗药物可能通过增ＪＪｎｃｏｘ一２的表达，减弱了自身对胃癌细胞的凋亡诱导效应，并进而可能导致肿瘤细胞对化疗的多药耐药性，因而提出
ＣＯＸ．２与ＭＤＲ可能存在相关性。

而且在实验中，有趣的发现肉豆蔻酸佛波脂（ＴＰＡ）不仅能够增加蛋白激酶ｃ（ＰＫｃ）的活性，诱导ＣＯＸ一２表达［”，同样能够促进ｍｄｒｌ／Ｐ—ｇｐ的药物外排作用【８】ｏ微管干扰类药物如：Ｔａｘｏｌ和ＶｉｎｂｌａｓｔｉｎｅＮ以诱导ｍｄｒｌ／Ｐ—ｇｐ表达，也能诱导ＣＯＸ一２表达Ｂ１０］。

己证明ｍｄｒｌ部分受至ＩＪＡＰｌ转录因子的调控，ＡＰＩ
扬州大学硕士论文一１４反过来又受到ＰＫｃ的调抖¨ｌ。

而我们知道前列腺素（ＰＧＥ２）作用下ＰＫＣ上调，ＰＧＥ２又是ＣＯＸ一２的产物，因此推澳Ｊｃｏｘ．２与ｍｄｒｌ／Ｐ－ｇｐ表达存在某种联系。

基于此，Ｖｉｍａｌ等［１２１通过腺病毒将ＣＯＸ．２ｅＤＮＡ转导到鼠肾小球系膜细胞后，观察Ｎｃｏｘ．２表达增高的同时，Ｐ一印表达水平亦增加，并且可被ＣＯＸ－２阻断ＮＮＳ一３９８所抑制。

临床还未见相关报道，为此我们用免疫组化检测了胃癌组织中ＣＯＸ．２、Ｐ．ｇＰ，如表２所提示２９例ＣＯＸ．２蛋白表达阳性的病例中有２４例Ｐ—ｇｐ表达同时阳性，１９例ＣＯＸ一２表达阴性病例中有１２例Ｐ—ｇＰ表达亦阴性，有显著相关性（Ｐ＜Ｏ．０１）。

其中具体机制尚不清楚，推测ｃＯｘ－２抑制剂可通过减少肿瘤的耐药性从而增强化疗药物的抗肿瘤作用。

已有研究发现使用ＣＯＸ．２抑制剂可显著增强化疗药物作用ｐ】，其是否通过减少Ｐ—ｇＰ表达从而起到逆转肿瘤耐药的特性有待进一步研究。

相信通过进一步探索ＣＯＸ．２与Ｐ—ｇＰ相关性的研究为使用ＣＯＸ．２抑制剂预防肿瘤耐药提供新的治疗靶点。

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参考文献
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扬州大学硕士论文
第二部分环氧合酶．２选择性抑制剂Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ调节胃癌细胞多药耐药性的实验研究
材料和方法
一．材料
ｌ研究对象
人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１为本实验室保存，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，由第四军医大学西京医院全军消化病研究所樊代明院士惠赠。

２．主要试剂：
塞莱昔布（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）辉瑞公司阿霉素ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ公司长春新碱奥康赛公司丝裂霉素江苏恒瑞顺铂齐鲁制药氟脲嘧啶上海海普药业新生牛血清杭州四季清四甲基偶氮哇盐（Ｍ１∞美国ｓｉｇｍａ公司二甲基亚讽（ＤＭＳＯ）美国ｓｉｇｍａ公司ＲＰＭｌｌ６４０美国Ｇｉｂｃｏ公司一抗鼠人抗Ｐ—ｇＰ单克隆抗体（即用型抗体）北京中山生物技术公司ＳＣ一１７４６山羊抗人ＣＯＸ一２多克隆抗体美国ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司３．主要仪器
Ｃ０２孵箱法国Ｄｅｎｍａｒｋ公司倒置显微镜重庆光学仪器厂超净工作台上海博讯公司医疗设备厂９６孔培养板，６孔培养板美国Ｃｏｓｔａｒ
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究１７
酶联免疫检测仪
台式高速（冷冻）离心机Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５８０４（Ｒ）流式细胞仪
病理ＩＰＰ图像分析软件系统（ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ）二研究方法美国ｂｉｏ．ｒａｄ５５０德国ｅｆｆｅｎｄｏｒｆ
美国ＢＤ公司南京东图数码
１．细胞系和细胞培养
细胞培养在含１０％新生牛血清的ＲＰＭＩ．１６４０培养基中，置３７。

Ｃ，饱和湿度，含５％Ｃ０２和９５％空气的Ｃ０２孵箱中培养。

每隔２－３天用０．２５％胰酶消化，以１：２．１：４传代一次。

ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ培养于含ｌｕｇ／ｍｌＶＣＲ的培养基中。

２．Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ的细胞毒性测定
采用ＭＴＴ比色法测定药物对细胞的毒性。

２．１取对数生长期的ＳＧＣ７９０１及ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞，用无血清的ＲＰＭＩ．１６４０液配置成细胞悬液。

２．２用计数板计细胞数后接种于９６孔培养板，每孑Ｌ细胞数为１Ｘ１０４个，加入无血清培养液２００ｕｌ／孑Ｌ，３７。

Ｃ孵育过夜，使两种细胞同步化。

２．３换入含有１０％新生牛血清的培养液，将Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ由低到高浓度（２．５，６．２５，１２．５，２５，５０，１００ｕｍｏｌ／１）加入９６孔板混匀培养，３７。

Ｃ，５％Ｃ０２下培养４８小时，各浓度设三个平行孔。

２．４倾去上清液，每ＴＬ力ＩＸ２０ｕ１ＭＴＴ，３７４Ｃ继续培养４ｈ，终止培养，弃去培养上清液，每孔加入ＤＭＳＯ１５０ｕｌ，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。

２．５选择４９０ｎｍ波长，在酶标仪上测各孔Ａ４９０ｎｌＴｌ，计算存活率：存活率＝实验组Ａ４９０ｎｒｎ／对照孔Ａ４９０ｎｍＸ１００％。

用各药物浓度一存活率做生长曲线。

２．６选取存活率大于９０％的药物浓度为该药的非细胞毒性药物剂量。

３．体外药物敏感性实验测定ＩＣ５０
采用ＭＴＴ法检测Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对两种细胞化疗药物敏感性的影响。

３．１实验分组
待检组：
扬州大学硕士论文
①在ＳＧＣ７９０１和ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中加入不同浓度的长春新碱（ＶＣＲ）、阿霉素（ＡＤＭ）、丝裂霉素（ＭＭＣ）、顺铂（ＣＤＤＰ）及氟脲嘧啶（５－ＦＵ），各浓度设３个平行孔。

②在两种细胞中加入不同浓度的各化疗药物和浓度非细胞毒性药物剂量的ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ，各浓度设３个平行孔。

对照组（阴性）：仅加细胞不加药物，各浓度设３个平行孔。

对照组（空白）：不加细胞和药物，设３个平行孔。

３．２实验流程
（１）取对数生长期的两种细胞，用Ｏ．２５％胰酶消化，用ＲＰＭＩ．１６．４０培养液制备成单细胞悬液，计数后接种于９６孔培养板中，每孔细胞数为１×１０４个，体积为２００ｕｌ。

细胞培养过夜，使细胞处于对数生长期。

（２）在９６孔板中加入非细胞毒性药物剂量的Ｃｅｌｅｅｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１），参照长春新碱（ＶＣＲ）、阿霉素（ＡＤＭ）、丝裂霉素（ＭＭＣ）、顺铂（ＣＤＤＰ）及氟脲嘧啶（５－ＦＵ）的血浆高峰浓度（ＶＣＲ０．５ｕｇ／ｍｔ，ＡＤＭ０．４ｕｇ／ｍｌ，ＭＭＣｌ．０ｕｇ／ｍｌ，ＣＤＤＰ３ｕｅ／ｒｒａ，５－ＦＵｌ０ｕ咖１）加入不同浓度（Ｏ．０１，Ｏ．１，ｌ，１０，１００倍ＰＰＣ）的各化疗药物。

（３）于３７＂Ｃ，５％Ｃ０２下培养４８ｈ，每孔加入新配置的ＭＴＴ２０ｕｌ，３７。

Ｃ下再培养４ｈ，终止培养，弃去上清液；每孔加入ＤＭＳ０１５０ｕｌ，振荡１０ｍｉｎ，使结晶物充分溶解。

（４）选择４９０ｒａｎ波长，酶标仪上测各孔的Ａ４９０ｎｍ，取每３个平行孔Ａ４９０１１Ｉｎ值的平均数，计算两种细胞存活率。

待检组～９０ｎｉｎ值一空白对照组Ａ４９０ｎｍ值
细胞存活率
阴性对照组Ａ４９０ｍ值一空白对照组山９０ｎｍ值×１００％
●
（５）以细胞存活率为纵轴，不同浓度各化疗药物为横轴在半对数坐标纸上分别绘制剂量一效应曲线图，并计算出两种细胞对各化疗药物的半数抑制浓度（Ｉｃ５０），即细胞抑制率达５０％时化疗药物的浓度。

按以下公式求出耐药倍数ｆｒｅｓｉｓｔａｌｌｃｅｆａｃｔｏｒ
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究望
ＲＦ）和逆转倍数（ｒｅｖｅｒｓａｌｉｎｄｅｘＲｊ）：
耐药细胞Ｉｃ５０
耐药倍数（ＲＦ）
逆转倍数（Ｒｊ）＝敏感细胞ＩＣ５０
Ｉｃ５０（抗癌药物）
ＩＣ５０（抗癌药物＋受试药物）
（６）实验重复三次
４．细胞内ＡＤＭ浓度测定
采用流式细胞仪（ＦｃＭ）检测细胞内药物浓度。

以０．２５％的胰酶消化并收取ＳＧＣ７９０１和ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞分装于不同的培养瓶中（５×１０４／ｍ１），加入含１０％新生牛血清的ＲＰＭｌｌ６４０培养液继续培养２４小时，给予不同处理因素：
①加入ＡＤＭ（终浓度５ｍｇ／ｍ１）
②加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１）和ＡＤＭ（终浓度５ｍｇ／ｍ１）
③加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１），２４小时后加入ＡＤＭ（终浓度５ｍｇ／ｍ１）
④加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１），４８小时后加入ＡＤＭ（终浓度５ｍｇ／ｍ１）
培养一小时后，收取细胞，以冷ＰＢＳ（Ｏ．０１ｍｏｌ，ｐＨ７．４）洗三次，再悬于冷ＰＢＳ中，于４＂Ｃ下保存，行流式细胞仪检测。

检测中使用的激发波长为４８８ｎｍ，接收波长为５７５ｎｍ。

５．Ｐ－卯表达的检测
５．１载玻片的处理
新购载玻片清水冲洗后，再用洗涤剂清洗，清水冲净后，干燥箱中烘干，置于含浓硫酸和重铬酸钾的清洁液中浸泡２４小时，清水冲净，烘干，放入培养皿，包装后高压灭菌，然后置于烤箱烘干备用。

５．２细胞爬片
（１）细胞分为四组：
①ＳＧＣ７９０１细胞
②ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞
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③在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１）作用２４ｈ
④在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ（２．５ｕｍｏｌ／１）作用４８ｈ
（２）将载玻片置于六孔板中，分别加入细胞１×１０４个／ｍ１，体系２Ｉｎｌ／孔，培养２４ｈ，细胞牢固贴壁于载玻片。

（３）倾去表面液体，用丙酮固定３０ｍｉｎ
５．３免疫组织化学二步法染色主要步骤
（１）从丙酮中取出爬有细胞的载玻片，用ＰＢＳ冲洗三次，每次３分钟（３×３’）；
（２）每张切片加一滴或５ｕｌ３％过氧化氢溶液，室温下孵育１０分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，ＰＢＳ冲洗（３×３’）：
（３）倾去ＰＢＳ液，每张切片加一滴或５０ｕｌ的一抗（Ｐ—ｇＰ），４℃过夜；
（４）ＰＢＳ冲洗三次，每次５分钟，除去ＰＢＳ液，滴加生物素标记的二抗，室温下孵育３０分钟，ＰＢＳ冲洗（３×３’）；
（５）除去ＰＢＳ液，滴加过氧化物酶标记的链霉卵白素３７。

Ｃ孵育３０分钟；ＰＢＳ冲洗（３×３７）；
（６）除去ＰＢＳ液，每张切片加一滴或５０ｕ１新鲜配制的ＤＡＢ溶液，显微镜下观察３－ｌＯｍｉｎ；
（７）自来水冲洗，苏木素复染３ｍｉｎ，Ｏ．１％盐酸分化３ｍｉｎ，自来水冲洗１０ｍｉｎ，ＰＢＳ返蓝：
（８）梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察；
（９）阳性对照：用己知的Ｐ一妒表达阳性的胃癌组织切片；
（１０）阴性对照：用ＰＢＳ代替一抗作阴性对照。

（１１）结果判断：Ｐ—ｇＰ表达部位为细胞膜和细胞浆，呈棕色。

三．统计学方法：
采用ＳＰＳＳ１０．０统计软件中的Ｔ检验作统计分析。

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ＡＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞Ｐ－ｇＰ表达（ｓＰｘ２００）
ＦｉｇＡｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇｐｉＩｌｔｈｅＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌ（ＳＰ×２００）
ＢＣｅｌｅｃｏｘｉｂ作用２４ｈ后ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞Ｐ－ｇＰ表达（ＳＰ×２００）
ＦｉｇＢｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇｐｉｎｔｈｅＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｔｈｅｃｅｌｅｃｏｘｉｂ２４
ｈｏｕｒ（ｓｐ×２００）
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
ＣＣｅｌｅｅｏｘｉｂ作用４８ｈ后ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞Ｐ－ｇＰ表达（ＳＰＸ２００）
ＦｉｇＣｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇｐｉｎｔｈｅＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｔｈｅｃｅｌｅｃｏｘｉｂ４８
ｈｏｕｒ（ｓＰ×２００１
ＤＳＧＣ７９０１细胞Ｐ－ｇＰ表达（ＳＰＸ２００）
ＦｉｇＤｔｈｅｐｏｓｉｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐ－ｇｐｉｎｔｈｅＳＧＣ７９０１ｃｅｌｌ（ＳＰ×２００）
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讨论
环氧化酶（ｃｏｘ）是催化前列腺素生物合成的限速酶，它有两种形式，即ＣＯＸ．１和ＣＯＸ一２。

近年来许多证据表明ＣＯＸ．２与肿瘤发生有关，其不仅在肿瘤中有较高表达，而且可能参与肿瘤的增殖、转移及分化【ｌ４１。

传统的非甾体类消炎药㈣ＳＡＩＤｓ）和选择性ＣＯＸ．２抑制剂已被证实可防治结肠癌、胃癌、和家族性结肠息肉病ｆｌＡＰ）的发生、发展【争８１。

最新研究表明，ＣＯＸ一２可能通过调节ＭＤＲｌ的表达而与肿瘤细胞产生多药耐药有关【９】，这也为ＣＯＸ一２提供了更多参与肿瘤的机制，同时也为ＣＯＸ．２抑制剂用于肿瘤防治开辟了一条崭新途径。

本实验应用的亲代人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１来自一女性患者，建系于１９７９年。

其耐药株ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞ＳＧＣ７９０１细胞经ＶＣＲ诱导产生，在体外连续培养６个月，稳定传代２５次，结果该细胞能在ｌｕｇ／ｍｌＶＣＲ浓度下持续增殖，并对顺铂（ＤＤＰ）、丝裂霉素（ＭＭＣ）、阿霉素（ＡＤＭ）矛Ｅ５．氟尿嘧啶（５．Ｆｕ）等药物产生了不同的交叉抗药性【１０ｌ。

我们应用ＭＴＴ比色法检测胃癌细胞ＳＧＣ７９０１及其耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ对各化疗药物（ＶＣＲ、ＤＤＰ、ＭＭＣ、ＡＤＭ、５－Ｆｕ）的敏感性，结果显示在相同药物浓度下，亲本细胞与耐药细胞相比对上述化疗药物具有更高的敏感性。

耐药细胞对药敏细胞的耐药性分别是ＶＣＲ１２．２倍、５．Ｆｕ１９．６倍、ＭＭＣ２．７倍、ＣＣＤＰ４．７倍、ＡＤＭ４．０倍。

我们进一步应用流式细胞仪测定细胞ＩＸ］ＡＤＭ的蓄积，结果发现耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ与敏感细胞ｓＧｃ７９０１相比细胞ＡＤＭ浓度减少８．２２倍，且具有显著性差异（Ｐ＜ｏ．０１），也说明ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞具有明显的耐药性。

目前研究表明ＭＤＲ的产生主要与细胞膜上Ｐ．ｇＰ过度表达有关。

李大强【１１］等研究发现ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞与ＳＧＣ７９０１细胞相比Ｐ—ｇＰ表达明显增高。

Ｐ一妇为ＡＴＰ依赖性跨膜转运蛋白，可将进入细胞内的药物泵出，使细胞内药物聚积减少，从而产生耐药。

本实验应用免疫细胞化学方法观察到ｓＧｃ７９０１／ｖｃＲ细胞Ｐ—ｇＰ表达明显高于ＳＧＣ７９０１细胞（Ｐ＜００１），进一步说明ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞耐药性的产生与Ｐ．ｇＰ表达增高，使细胞内药物外排增多有关。

人胃癌细胞株ＳＧＣ７９０１为中分化腺癌细胞，李玲【１２１等研究表ＨＹ］ＳＧＣ７９０１及其耐药株ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ高表
刘军：环氧合酶一２与胃癌多药耐药相关性的实验研究
达ＣＯＸ－２。

Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ是一种新一代高效的ＣＯＸ一２选择性抑制剂，对ＣＯＸ．１的亲和力极弱，几乎无抑制作用，常用剂量的Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ不影响由ＣＯＸ一１激活的前列腺素等炎症物质的合成，因此不干扰组织中与ＣＯＸ．１相关的正常生理过程，尤其是在胃肠、血小板和肾组织中。

从而避免了传统的ＮＳＡＩＤ引起的严重消化道并发症（出血、穿孔）、其他胃肠道不良反应，以及不影响血小板功能。

ＭＴＴ结果显示２．５ｕｍｏｌ／１Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ浓度组细胞抑制率与其他组相比差异有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１），经２５ｕｍ０１／１～１００ｕｍｏｌ／１Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用２４ｈ后，９０％以上的细胞被抑制，细胞抑制率无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５），说明在一定浓度范围内，增加药物剂量并不能增加疗效。

证实良好的抗肿瘤的作用。

有研究表明㈣胃癌治疗中ＣＯＸ．２选择性抑制剂与５．Ｆｕ，ＤＤＰ等化疗药合用，可明显提高胃癌的化疗效果，提示ＣＯＸ一２选择性抑制剂对化疗药具有增敏作用。

另有报道ＣＯＸ一２选择性抑制剂可增加具有耐药表型的恶性肿瘤对化疗药的敏感性，提示ＣＯＸ一２选择性抑制剂可能对耐药性具有逆转作用‘１４１。

本实验结果显示当２．５ｕｍｏｌ／１Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ与化疗药物联用时，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ能使ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞对多种化疗药物的ＩＣ５０值（ｎｇ／ｍ１）下降，其逆转倍数为１．０９．６．２８。

逆转效率的高低与化疗药物种类有关，其中以ＶＣＲ和５．Ｆｕ的逆转倍数和相对逆转率较高，而Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对敏感细胞无增敏作用。

此结果证明Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对人胃癌耐药细胞株的ＭＤＲ具有逆转作用。

我们进一步应用流式细胞仪测定细胞内ＡＤＭ的蓄积，结果显示加入Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ后ＳＧＣ７９０１～ＣＲ细胞内ＡＤＭ浓度由９．６６略降为９．４８，但无显著性差异（Ｐ＞Ｏ．０５）；Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用后２４ｈ及４８ｈ再加入ＡＤＭ，耐药细胞内ＡＤＭ浓度分别为１５．９７和２３．７８。

分别增加１．６５和２．４６倍口＜０．０１），且Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用后４８ｈ与２４ｈ相比耐药细胞内ＡＤＭ浓度增加更为明显（Ｐ＜Ｏ．０１）。

说明Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ增强ＡＤＭ对耐药细胞的毒性作用是由于提高了耐药细胞内的药物含量所致，月．药物浓度的增加具有时间依赖性。

为进一步探讨Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ逆转ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞耐药性的机制，本实验利用
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免疫细胞化学方法，通过图像分析系统检测Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞Ｐ—ｇｐ表达的影响，结果发现应用Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ２４ｈ和４８ｈ后ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的Ｐ－印表达受到抑制（Ｐ＜０．０５），提示Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ可通过抑制ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的Ｐ－ｇｐ表达而逆转耐药。

同时我们还发现Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作用２４ｈ及４８ｈ后Ｐ—ｇｐ表达明显下降，且具有时间依赖性（Ｐ＜０．０５）。

这与Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ增加ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞对ＡＤＭ敏感性的时间依赖性吻合。

此结果进一步证明Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对人胃癌耐药细胞株的ＭＤＲ具有逆转作用。

Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ逆转耐药机制不仅是Ｐ．ｇＰ表达下降，还可能涉及其他耐药机制。

也有研究表明，化疗药物产生耐药的原因之一是化疗药物接触肿瘤后可诱导肿瘤细胞ＣＯＸ．２的表达，进而诱导抗凋亡基因ｂｃｌ一２的表达。

在传统的化疗方案中联合应用ＮＳＡＩＤ、可阻断这一耐药机制，大大提高化疗效果‘“】。

这方面有待讲一步研究。

综上所述，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ与化疗药物联用既有复合抗癌作用，又能逆转肿瘤细胞的ＭＤＲ，且小剂量的Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ即可达到耐药逆转，本实验观察２．５ｕｍｏｌ／１的Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ可有效逆转耐药，这一剂量在Ｉｌ缶床治疗中极易达到，不会引起明显的毒副作用。

因此，Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ作为肿瘤多药耐药逆转剂具有较大的研究价值和应用前景。

我们将进一步应用基因转染等分子生物学方法证实Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ对胃癌多药耐药性的逆转，进而指导临床应用免疫治疗和基因治疗逆转ＭＤＲ。