第四章-发酵工程的灭菌与空气除菌

7、杀灭细菌芽孢的温度和时间
成熟的细菌芽孢除含有大量的钙-吡啶二羧酸成分外，还处于脱水 状态，成熟芽孢的核心只含有营养细胞水分的10%～30%。这些特性 大大增加了芽孢的抗热和抵抗化学物质的能力。
在相同温度下杀灭不同细菌芽孢所需时间不同，一方面因为不同 细菌芽孢对热的耐受性不同，另外培养条件的不同也使耐热性产生差 别。
在发酵过程中夹杂其它杂菌会造成严重的后果
如，生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；在连 续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得 更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；杂菌及其产生的物 质，使提取精制发生困难；杂菌会降解目的产物；杂菌 会污染最终产品；发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发 生溶菌现象。
优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分的现象，发 酵罐利用率低。 灭菌流程：培养基的加热一般用直接蒸汽通入罐内，冷却是冷却 水通入蛇管或夹层间接进行。灭菌时间过程包括：加热、维持、 冷却所需要的时间。
• 流程操作：先预热一定时 间，使物料溶胀均匀受热， 预热90℃以上时，将蒸汽 直接通入培养基及罐中，
一、定义 1、培养基灭菌的定义
是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及 其孢子，或从中将其除去。工业规模的液体培养 基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。 2、灭菌与消毒的区别 • 灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或 除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽 孢和孢子 • 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿 内外的病源微生物。
表 多数细菌芽孢的灭菌温度与时间
8、影响培养基灭菌的因素
（1）培养基成分
培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高 浓度盐类、色素能削减其耐热性。
随着灭菌条件的强化,培养基成分的热变质加速，特别是维生素。因此 培养液灭菌一般都采用高温短时加热的方式，这样可以达到彻底灭菌 和把营养分破坏减少到最低限度的目的。
（8）搅拌
避免局部过热或形成灭菌死角
二、培养基的灭菌
无菌的标准：根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是 很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3。
工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌方式，主要有两种方法： 分批灭菌和连续灭菌。
分批灭菌和连续灭菌比较
连续灭菌与分批灭菌比较具有很多优点，尤其是当生产规模大 时，优点更为显著。主要体现在以下几方面：① 可采用高温短时灭 菌，培养基受热时间短，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； ② 发酵罐利用率高；③ 蒸汽负荷均衡；④ 采用板式换热器时，可 节约大量能量；⑤ 适宜采用自动控制，劳动强度小。
基。
（6）冷空气排除情况
高压蒸汽灭菌的关键是为热的传导提供良好条件，而其中最重要的是 使冷空气从灭菌器中顺利排出。因为冷空气不但导热性差，阻碍蒸汽 解除欲灭菌的物品，还可会降低蒸汽分压，使罐内实际温度低于压力 表所对应的温度，造成灭菌温度不够。
（7）泡沫
泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，需加消泡剂。
①K 与菌种的特性有关
• 相同温度下，微生物越耐热，k值越小。
• 相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。
②K 与灭菌温度有关
K=A·e –⊿E/ RT（遵循阿仑乌斯定律） lgK =-⊿E/(2.303RT)+lgA A：比例常数 R：气体常数（J/ (mol·K)） T：绝对温度（K） ⊿E：杀死细菌所需的活化能（J/ mol）
③ 过滤除菌：使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，出去 微生物的方法。主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养 基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。
④湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使 生物大分子化学键受到破坏。常用于培养基、发酵设备、附属设备、 管道和实验器材的灭菌。
可减少冷凝水生成量。温 度达到120℃时计算维持时 间。生产中常用维持时间 30min。为了减少营养成分 的破坏多采用快速冷却方
式，立即向罐内通入无菌 空气，以维持罐压,然后开 启冷却系统进行冷却。
分批灭菌设备示意图
三路进汽：蒸汽从通风、 取样和出料口进入罐内 直接加热，直到所规定 的温度，并维持一定的 时间。这就是所谓的 “三路进气”。 四路出汽：在液面以上 的管道口则应排放空 气，即蒸汽从排气、接 种、进料和消沫剂管排 气。这样做可以达到不 留灭菌死角。
因此，要求保证纯种培养，在接种前，要对发酵罐、管道、 空气除菌系统及补料系统等设备进行空气消毒，对培养 基、消泡剂、补料液和空气需彻底除菌，还要对生产环 境进行消毒处理，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。
本章内容
• 第一节 常用的灭菌方法 • 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 • 第三节 空气的除菌
第一节 常用的灭菌方法
(N为活细菌数，t为受热时间，k热死速率常数） 对上式积分得：N=N0e-kt 或：t =ln(N0/N)/k (N0为开始灭菌时的活细菌数；N为经时间t后残存的活细菌数） 可以根据残留菌数的要求用上式计算灭菌时间t0 （理论N=0，实际N=0.001）
几种微生物的对数残存量与时间的关系曲线
6、反应速率常数K
二、工业生产中的灭菌
1、工业上具体措施包括 （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； （3）设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。 2、培养基灭菌的目的
杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。
• 间歇灭菌法：反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和 芽孢的目的。100 ℃ 30-60min而杀死微生物营养体，置37 ℃培养1h， 使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适用于 不能高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基等。
• 高压蒸汽灭菌：使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1 兆帕（MPa，一公斤的压力），121 ℃ 15-30min，可杀死各种微生物 及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。
2）灭菌温度和时间的确定取决于： （1）杂菌孢子的热灭死动力学 （2）反应器的形式和操作方式 （3）培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
5、生物热死动力学（对数残存定律）
在一定的温度下，微生物致死遵循分子反应速率理论，即：
表达式：dN/dt=-kN，即微生物的死亡速率（dN/dt）与任何一瞬间残 留的活菌数成正比，所以称为对数残存定律。
本章内容
• 第一节 常用的灭菌方法 • 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 • 第三节 空气的除菌
第二节 培养基与发酵设备的灭菌
一、灭菌的机理 （一）化学灭菌机理：化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与
微生物细胞中的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、 核算的破坏、酶的失活、细胞膜头型的改变而杀死微生物。 （二）紫外线灭菌机理：在紫外线照射下微生物细胞的DNA 遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制 DNA的复制。此外，空气在紫外线照射下生成的臭氧也有 一定的杀菌作用。 （三）干热灭菌机理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的 各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生 物。
• 煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸15-20min，一般微生物细胞可杀死， 但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60℃ 10min，芽
孢用100℃ 10min，嗜热细菌用120℃ 20-30min可完全杀死。
• 巴氏消毒法：有的食物经煮沸或用更高的温度处理会损害它的营养价 值或色香味，则采用巴氏消毒，已达消毒和防腐目的。60-62 ℃ 30min或70 ℃ 15min，以杀死其中的病原菌或部分微生物的营养体。 适用于牛奶、啤酒、黄酒酱油、醋等食品。
但当培养基中含有固体颗粒或培养基有较多泡沫时，以采用分 批灭菌为好，因为在这种情况下用连续灭菌容易导致灭菌不彻底。 对于容积小的发酵罐，连续灭菌的优点不明显，而采用分批灭菌比 较方便。
（一）分批灭菌（b灭菌，就是将配制好 的培养基全部输入发酵罐内或 其他装置中，通入蒸汽将培养 基和所用设备加热至灭菌温度 后维持一定时间，再冷却到接 种温度，这一工艺过程称为实 罐灭菌，是使培养基和发酵罐 同时灭菌的一种方式。
各种微生物对湿热的相对热阻
2、湿热灭菌的优点
蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒；蒸汽有强的穿透力，灭菌易 于彻底；蒸汽有很大的潜热；操作方便，易管理。
3、湿热灭菌的机理
• 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围。当微生物处于最低温度 以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。当温度超过最高限度时， 微生物细胞中的原生质胶体和酶起了不可逆的凝固变性，使微生物在 很短时间内死亡，加热灭菌即是根据微生物这一特性而进行的。
3、培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组
分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：
• 培养基中不同营养成分间的相互作用； • 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4、灭菌的方法
（1）化学法（化学药品灭 菌法）：化学药品直接 作用于微生物而将其杀 死的方法。消毒剂与防 腐剂的区分并不严格， 常用的化学药剂有：石 碳酸、甲醛、氯化汞、 碘酒、酒精等。主要用 于生产车间环境、无菌 室空间、接种操作前小 型器具及双手的消毒等 以及染菌后的培养基。 根据灭菌对象的不同使 用方法有浸泡、添加、 擦拭、喷洒、气态熏蒸 等。
（四）湿热灭菌
1、湿热灭菌中的相关定义
杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀 死全部微生物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上， 温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度 和加热方式）下的致死时间。一般评价灭菌彻底与否的指 标主要是看能否完全杀死热阻大的芽孢杆菌。
（2）培养基成分颗粒度
培养基成分的颗粒越大，蒸汽穿透所需时间越长。小于1mm颗粒的培 养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤 维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则 应适当提高灭菌温度或过滤除去。
（3）培养基pH
pH对微生物耐热性影响很大。微生物一般在pH6.0～8.0时最耐热； pH＜6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促 使其死亡。pH越低，灭菌所需时间越短。
（4）微生物细胞含水量
含水量少，蛋白质不易变性，但在灭菌时，如果是含水量很高的 物品，高温蒸汽的穿透效果也会降低，所以灭菌时间也要延长。
（5）微生物性质与数量
各种微生物对热的抵抗力相差较大，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌 丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子对热的抵抗力较强；
繁殖期的微生物对高温的抵抗力比衰老期微生物抵抗力小得多； 微生物数量越多，所需灭菌时间越长； 天然原料配成的培养基含菌量高于纯粹用化学试剂配制成的组合培养
（2）物理法
① 干热灭菌法 ：灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品 在干热灭菌器中，于160℃下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过 170℃。
②射线灭菌法：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的γ射线进行 灭菌的方法，波长范围在200～275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌 作用最强的范围是250 ～270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用 最强。在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 ～5min，芽孢约 10min即可杀灭。但其穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、 无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对 杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学 灭菌结合使用。
• 微生物受热死亡的原因主要是高温使微生物体内的一些重要蛋白质发 生凝固、变性，而致使微生物。
• 致死温度、致死时间两者呈反比 • 一般情况微生物营养体60℃ 10min即可死亡，但是细菌芽胞需要
100℃ 几十分钟及数小时才能被杀死。
4、培养基湿热灭菌需解决的工程问题
1）将培养基中的杂菌总数N0 杀灭到可以接受的总数N（10-3） 需要多高 的温度、多长的时间为合理。