产L_乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

α文章编号:1008-3464(2007)增-0016-06
产L 2乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建
陈五九1,王成华1,王利英1,韦宇拓1,2,黄日波1,2
(1　广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530005;
2　广西亚热带生物资源保护利用重点实验室,广西南宁530004)
摘要:含有质粒pKD 46的菌株BW 25113,在L 2阿拉伯糖诱导后,表达Κ噬菌体的3个重组蛋白Exo 、Bet
和Gam ,宿主菌就具有了同源重组的能力。

利用Κ噬菌体的R ed 重组系统构建了D 2(+)2乳酸脱氢酶基因
(ld hA )、乙醇脱氢酶基因(ad hE )双突变的大肠杆菌BW 25113C 工程菌株和乙酸激酶基因(ackA )单突变
的大肠杆菌BW 25113工程菌株。

将表达牛链球菌L 2乳酸脱氢酶基因(ld hL )的pSE 380质粒转化到BW 25113C
菌株中发酵培养35h ,用HL PC 检测产物,尚未发现L 2乳酸。

关键词:R ed 重组系统,L 2乳酸脱氢酶,L 2乳酸
中图分类号:Q 78 文献标识码:A
Con struction of eng i neered E scherich ia coli produc i ng L -lacta te
CH EN W u 2jiu 1,W AN G Cheng 2hua 1,W AN G L i 2ying 1,W E I Yu 2tuo 1,2,HUAN G R i 2bo
1,2(Institute of Enzym e and Ferm entation ,Co llege of L ife Science and Techno logy ,
GuangxiU niversity ,N anning 530005,China )
Abstract :P las m id p KD 46can exp ress th ree p ro tein s :Gam ,B et and Exo 1BW 25113w ith pKD 46has the functi on of recom b inati on w hen induced by L 2arab ino se 1T he tw o ld hA 、ad hE gene w ere deleted in E scherich ia coli BW 25113C and ackA w as deleted in E 1coli BW 25113u sing hom o logou s recom b inati on 1T he recom b inan t p las m id p SE 3802ld h w h ich exp ressed the L 2(+)2lactate dehydrogenase of S trep tococcus bov is w as tran sfo r m ed in to E 1coli BW 25113C 1T he BW 25113C p SE 3802ld h w as Shake 2flask Fer m en t 2cu ltivati on fo r 35h ,u sing the HL PC to detect the fer m en tati on p roducts ,bu t had no t fonnd the L 2lactate yet 1
Key words :red recom b inati on system ;L 2(+)2lactate dehydrogenase ;L 2lactate
近年来,利用微生物生产高纯度的L 2乳酸成为国际的研究热点,但是自然界中能生产L 2乳酸的微生物极少。

随着基因工程的飞速发展和广泛应用,利用基因工程的方法构建L 2乳酸高产菌株成为人们研究的焦点。

天然的大肠杆菌没有L 2(+)2乳酸脱氢酶,没有L 2乳酸产生。

许多研究人员将不同来源的LDH 基因引入大肠杆菌,转化葡萄糖生产L 2乳酸[127]。

本研究利用Κ噬菌体的R ed 重组系统构建了ld hA 、ad hE 双缺失的大肠杆菌BW 25113C 工程菌株,
ackA 缺失BW 25113的工程菌株。

并将表达牛链球菌L 2(+)2乳酸脱氢酶基因的p SE 380质粒[8]转化到
BW 25113C 菌株中,期望在大肠杆菌中建立新的L 2乳酸代谢途径,探索构建能兼性发酵五碳糖和六碳第26卷增刊V o l 126,Sup.
广西农业生物科学Journal of GuangxiA gric .and B i o l .Science 2007年6月　June,2007　
α收稿日期:
2007-05-29; 修回日期:2007-06-14。

基金项目:
国家高技术研究发展计划(“863”计划)(2003AA 001039)。

作者简介:
陈五九(1980-),男,安徽安庆人,硕士研究生;E 2m ail :jiuzi 59@1631com 。

通迅作者:黄日波,教授,博士生导师;E 2m ail :riboh @public 1nn 1gx 1cn 。

糖、生产高纯度L 2乳酸的基因工程菌的途径。

1　材料和方法
111　菌株和质粒
pKD 46为同源重组的协助质粒,是温度敏感复制子,高于37°C 时该质粒会丢失,在L 2阿拉伯糖诱导后表达Gam ,B et 和Exo 三个Κ噬菌体重组酶。

pKD 3、p KD 4为PCR 扩增提供氯霉素和卡那霉素抗性基因的模板,抗性基因两侧有FR T 位点(FL P 重组酶识别位点),为重组转化体提供筛选标志。

pCP 20是FL P 重组酶的表达质粒,复制子为温度敏感型,42°C 诱导FL P 重组酶表达,同时质粒也逐渐丢失,该质粒用于消除FR T 位点间的抗性基因。

BW 25113 pKD 46、p KD 3、pKD 4、pCP 20是由W anner 博士馈赠[9],pSE 3802ld h 为本实验室保藏。

112　试剂
pM D 182T 载体、DNA M arker 、T aq DNA 聚合酶购自T aKaR a 公司;氨苄青霉素和氯霉素、卡那霉素均购自上海生工公司;L 2阿拉伯糖购自捷瑞生物工程公司;质粒提取试剂盒购自Om ega 公司;DNA 胶回收试剂盒购自T iangen 公司;测序委托大连T aKaR a 宝生物工程公司完成,PCR 引物由上海生工公司合成。

113　扩增条件和PCR 引物设计
扩增基因的引物名称和引物序列见表1。

PCR 条件:94°C 预变性2m in ,然后94°C 3O s ,52°C 30s ,72°C 1m in ,完成35个循环后72°C 延伸10m in 。

做6个PCR 反应,产物使用胶回收试剂盒,最后溶与40ΛL 灭菌去离子水里。

表1　敲除基因的同源序列和鉴定序列
Tab 11　Ho m ology sequences for knock i ng -out and iden tify i ng sequences
引物名称N am e of p ri m er
引物序列P ri m er sequences adhEc m
5′2CT GAA CCAA TCGGTA T TA T T T GCGGTA TCGT TCCGA CCA GTCT T GA GCGA T T GT GTA GG 23′5′2T TCA GT GCCT GCA GA GCCT GA CCA TCA GA GAA CTCA GA TCT TAA CGGCT GA CA T GGGAA 23′adhE
5′2A T GGCT GT TA CTAA T GTCGC 23′5′2CTA CT GA T TAA GCGGA T T T T 23′ldhA km
5′2A CA GGT GAA CGA GTCCT T T GGCT T T GA GCT GGAA T T T GTCT T GA GCGA T T GT GTA GG 23′5′2T TCAA CA GA T GA TA GT T T TCCGGT GTCA gCGGGCA GTCT TAA CGGCT GA CA T GGGAA 23’ldhA
5′2A T GAAA CTCGCCGT T TA TA G 23′5′2GA GCGGCAA GA T TAAA CCA G 23′ackA c m
5′2CCggAA gA gTCT TA CCTCTA CgCCCT gCCT TA CAA CC gT gTA ggCT ggA gCT gCT TC 23′5′2T gCgTCAA CgCTCA T gCCCA gggT gTCgT gCA ggT ggA T gggAA T TA gCCA T ggTCC 23′ack 5′2A CA CCgCgT TCCA CCA gA CT 23′
5′2CCA gA CgA CCA TCCA TCA gC 23′
注:adhEc m 是以pKD 3为模板的引物;adhE 是鉴定引物;ldhA km 是以pKD 4为模板的引物;ldhA 是鉴定引物;划线部分为目的基因内部的同源序列;ackA c m 是以pKD 3为模板的引物,ackA 是鉴定引物。

N o te :adhEc m and ackA c m rep resent the p ri m ers fo r p late pKD 3;adhE rep resents the identifying p ri m ers ;ldhA km rep resent the p ri m ers fo r p late pKD 4;ldhA and ackA rep resent the identifying p ri m ers 1Straigh t line rep resent the homo logy sequences to the ai m gene 1
114　电击感受态细胞的制备和电击转化
将BW 25113 p KD 46菌株30°C 培养过夜,次日按1∶100接种于10mL LB 培养基中,30°C 培养至
OD 600=0125时,加入L 2阿拉伯糖至终浓度为10mm o l L ,培养1h 左右,至OD 600值015
～016,冰上预冷10m in ,3500r m in 、4°C 离心10m in ,弃培养基,用高压灭菌去离子水洗涤3次,最后用50ΛL 灭菌去离子水重悬细菌,制成所需的电击感受态细胞。

随后立刻做电击转化。

将同源臂引物扩增的氯霉素(卡那霉素)抗性基因片段约200ng 加入感受态细胞,混匀,转入012c m 电击杯中,用B i o 2R ad 电击仪作电转化。

电击条件:2008,25ΛF ,电击电压215kV ,电击时间为4～5m s ,电击后迅速加入1mL 的SOC 培养基,150r m in ,37°C 培养1h ,之后涂于氯霉素平板(氯霉素浓度为25Λg mL )
71增刊陈五九等:产L 2乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建
或卡那霉素平板(卡那霉素浓度25Λg mL )上,24h 后用PCR 法鉴定长出的阳性克隆。

115　筛选和验证
由于所用的线性打靶DNA 中间含有抗性基因,与目的基因片段同源双交换后即可整合到宿主菌中。

利用这个特点进行正向抗生素筛选,初步获得阳性克隆。

打靶基因同源序列是在基因内部,验证引物是在基因两端。

由于目的基因和突变体的整合基因大小有一定的差异,因此,可以通过对野生型和突变株的目的基因进行PCR 验证(引物是相同的),看片断大小是否与预期一致。

116　抗性基因的消除
pCP 20是带有氨苄青霉素和氯霉素抗性基因的质粒,热诱导后可表达F lp 重组酶,该酶可特异性识别FR T 位点,通过重组可将FR T 位点间的序列删除,只保留一个FR T 位点。

pCP 20转入氯霉素(卡那霉素)抗性阳性菌株,30°C 培养1h ,后涂无抗性平板到42°C 过夜,热诱导FL P 重组酶表达,质粒也逐渐丢失。

用牙签挑相同单菌落,在无抗性和抗性平板上做对照实验,获得在无抗性平板生长而在抗性平板未生长的菌落。

可初步断定抗性基因已被F lp 重组酶删除,随后用鉴定引物对抗性消失的菌落进行PCR 鉴定。

117　表达质粒转化双突变和单突变质工程菌株
将含有有牛链球菌L 2乳酸脱氢酶基因(ld hL )的重组表达质粒p SE 3802ld hL ,转化进经实验验证的单基因缺失或者双基因缺失的突变体中,即构成双突变体或者单突变体的工程菌株。

质粒转化过程参考文献[10]进行。

118　B W 25113C pSE 380-ldhL 发酵产物L -乳酸的检测
含有表达牛链球菌L 2乳酸脱氢酶基因(ld hL )的p SE 380质粒的工程菌株BW 25113C 100mL 发酵培养35h ,用超纯水稀释硫酸配制pH 216为流动相,用C 8柱检测发酵产物。

2　结果
211　大肠杆菌B W 25113A (∃ldhA ∷Kam ),B W 25113B (∃ldhA ∷FR T )ldhA 缺失突变体PCR 验证
用鉴定引物对野生型BW 25113、工程菌株BW 25113A 和缺失ld hA 卡那霉素抗性基因的BW 25113B 分别进行PCR 验证。

PCR 扩增产物在018%琼脂糖凝胶上电泳分析,结果显示,野生型BW 25113的ld hA PCR 扩增片段大小为1000bp ,而具有卡那霉素抗性基因的BW 25113A 的ld hA PCR 扩增片段大小为2000bp (图1)。

BW 25113A 去卡那霉素抗性基因后得到的BW 25113B 的ld hA PCR 扩增片段大小为600bp (图2)。

此结果与理论预测值一致,表明D -乳酸脱氢酶敲除成功。

81广西农业生物科学第26卷　
为进一步证实核酸序列,对去抗性后的突变体ld hA 的PCR 产物进行测序,结果显示,ld hA 同源区内序列已被卡那霉素抗性基因替换,确实只剩下一个FR T 序列(图3)。

图3　ldhA 突变体B W 25113B 序列测定图
F ig 13　The sequence of B W 25113B deleti ng the ldhA gene
H 1是基因上游同源臂;H 2是基因下游同源臂
H 1rep resent the up stream homo logy sequences ;H 2rep resent the dow nstream sequences 1
212　大肠杆菌B W 25113(∃ackA ∶FRT ,∃adhE )双突变体的PCR 验证
用鉴定引物对野生型BW 25113、工程菌株BW 25113C 进行PCR 验证。

PCR 扩增产物在018%琼脂糖凝胶上电泳分析,结果显示,野生型BW 25113的ad hE PCR 扩增片段大小为2678bp ,而具有氯霉素抗性的BW 25113C 的ad hE 片段大小为2000bp (图4),与理论预测值一致,表明乙醇脱氢酶敲除成功。

213　大肠杆菌BW 25113(∃ackA ∶Cm )突变体的PCR 验证
用鉴定引物对野生型BW 25113、工程菌株BW 25113D 进行PCR 验证。

PCR 扩增产物在018%琼脂糖凝胶上电泳分析,结果显示,野生型BW 25113的ackA 片段大小为530bp ,而具有氯霉素抗性的BW 25113D 的ackA PCR 扩增片段大小为1300bp (图5),与理论预测值一致,表明乙酸激酶敲除成功。

91增刊陈五九等:产L 2乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建
214　BW25113C p SE3802ld h发酵产物L2乳酸的检测
通过对发酵产物和乳酸标样HL PC检测对比,尚未在发酵产物中发现L-乳酸。

215　同源臂间距对重组效率的影响
ad hE、ld hA、ackA设计的同源臂间距分别为1661bp、524bp、251bp。

本实验中,ad hE、ld hA 两个基因敲除效率都很高,周期较短,但是ackA基因敲除效率很低,而且周期很长。

存在这样的差异性,可能与ackA设计的同源臂间距较短有关,而有关同源臂间距对重组效率之间的关系目前还没有相关报道。

表2　敲除基因的同源臂的相关数据
Tab12　The relative i nfor mation for gene knock-out
基因Gene
同源臂长度 bp
Homo logy sequence
同源臂上游位置 bp
Sites fo r up stream
homo logy sequeces
同源臂下游位置 bp
Site fo r dow nstream
homo logy sequences
同源臂间距 bp
Space
重组效率
R ecom binant
efficiency
ad hE39302～3402001～20391661高
ld hA3751～87611～647524高
ackA37472～508759～795251低
3　讨论
乙酸激酶是大肠杆菌E M P代谢途径中比较重要的一个基因。

大肠杆菌高密度培养过程中往往会积累大量的有害副产物,尤其是乙酸的积累,它不仅会抑制菌体生长,而且抑制重组蛋白的表达。

而乙酸激酶的缺失会大大降低大肠杆菌在生长过程中积累的酸,从而减少过多的酸造成对菌体生长的抑制[11,12]。

本实验多次的构建ad hE、ld hA、ackA三个基因缺失的大肠杆菌工程菌株,由于ackA的重组效率低,敲除的成功率不高,并多次出现了假阳性,都未能成功。

因此,乙酸激酶的缺失与发酵产物中能检测到L2乳酸密切相关。

天然的大肠杆菌只能产D2乳酸。

Zhou等[13]研究表明,将丙酮酸甲酯裂解酶基因(pf l B)突变, D-乳酸的生成速率将会提高70倍。

因此,当pf l B突变缺失,再引入外源的L2(+)-乳酸脱氢酶后可以提高L-乳酸的产量。

我们下一步的工作是突变大肠杆菌代谢途径中更多的基因,并对发酵产L-乳酸条件优化。

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