人乳头瘤病毒16型治疗性疫苗联合免疫效果研究

根据Ｈ Ｐ Ｖ１ ６ Ｅ ６ 、 Ｅ ７ 蛋 白的氨基 酸序列 ， 以每 １ ５ 个 氨基 酸 为一 条 短 肽 ， 重叠 １ １ 位 分别 建立 Ｅ ６ 、 Ｅ ７肽 库， 由北 京 中 科 亚 光 生 物 科 技 有 限 公 司 合 成 ， 纯 度 为
７ ５ ％ ～９ ８ ％ 。
细胞 由本 室 冻 存 ； 重 组 腺病 毒 单 斑株 冻 存液 由本 室 构 建 保 存 ； ＨＰ Ｖ１ ６ Ｌ ２ 、 Ｅ ６ 、 Ｅ ７ 蛋 白 抗 原 由 本 室 制
备 ； 小鼠Ｉ Ｆ Ｎ 一 ￣ ／ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ｐ Ｏ Ｔ试 剂 盒 购 自 Ｕ — ｔ ｙ Ｔ ｅ ｃ ｈ 公
的 目的 。
１ 材 料 和 方 法
１ ． １ 材 料
Ｃ ５ ７ Ｂ Ｌ ／ ６ 小 鼠， ６ ～ ８ 周龄 ， 雌性 ， 购 自中 国 医 学 科 学 院实 验 动物 繁育 中心 ， 在Ｓ Ｐ Ｆ ２ 级 动物房 饲 养 ； ２ ９ ３

ＨＰ Ｖ预 防 性 疫 苗 的 免 疫 策 略 主 要 集 中在 如 何 诱
１ ． ３ ＨＰ Ｖ １ ６ Ｅ ６ 肽库 和 Ｅ ７ 肽 库 的 制 备
在 治 疗性 疫 苗 的研 究 中人 们 发 现 ， 用Ｈ Ｐ Ｖ１ ６ 相 关 多 肽伟 、 病毒 载体 疫苗 （ 痘苗 病 毒 ） 、 蛋 白疫 苗 临 床试 验
治疗 Ｈ Ｐ Ｖ相 关 疾 病 ， 疫 苗 可 以 在 病 人 体 内诱 发 产 生 抗 原 特 异性 Ｃ Ｔ Ｌ 反应 ， 有 的甚 至 出 现 了 临床 上 病灶 的缓 解 和 消失 。但 同 时发 现 ， 用 传 统 的 相 同 疫 苗 多 次 重 复 免疫 的策 略 和模 式 存 在 缺 陷 ， 即 多 次 重 复 应
任 皎等 ： 人乳头瘤病毒 １ ６ 型 治 疗 性 疫 苗 联 合 免 疫 效 果 研 究
２ ０ ｌ
特 异 性 的 细 胞 毒 Ｔ细 胞 （ Ｃ Ｔ Ｌ ） 已 经 在 宫 颈 上 皮 内 瘤 变（ Ｃ Ｉ Ｎ） 病人 ｆ ２ 、 宫 颈 癌 患 者 乃 至 ＨＰ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ检 测 阳 性 的健 康人 恤 液 中得 到 确 认 。 Ｈ Ｐ Ｖ相 关 疾 病 与 机
发 出针 对 Ｈ Ｐ Ｖ主要 壳 蛋 白 Ｌ １ 相 关 表 位 的 高 滴 度 中
和抗 体 来 预 防感 染 。在这 方 面 ， 在 动 物 实验 和 临 床
试 验 中 均 表 现 出 良好 的 预 防 ＨＰ Ｖ感 染 的 效 果 。 然 而就 治 疗 性疫 苗 而 言 ， 诱 发 机 体 产 生 针 对 病 毒 早 期 抗 原 的 细 胞 免 疫 来 清 除 被 病 毒 感 染 的 细 胞 和 相 关 病 变 肿 瘤 细胞 是 关 键 性 问题 。 由 于 Ｈ Ｐ Ｖ１ ６ 早期蛋 白 Ｅ ６ 、 Ｅ ７ 是 诱 导 和 维持 癌 细 胞 恶 性 表 型所 必 需 的 ， 因 而 成 为 治疗 性 疫 苗 理想 的靶 抗 原 ， 各 种 以 它 们 为 靶 抗 原 的 治 疗 性 疫 苗 在 动 物 实 验 上 均 表 现 出 良好 的 细 胞 免疫 。 以Ｈ Ｐ Ｖ Ｌ １ 病毒样颗粒 （ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ — ｌ ｉ ｋ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｌ ｅ ｓ ， Ｖ Ｌ Ｐ ） 为 基 础 的宫 颈 癌 预 防性 疫 苗 Ｇ ａ ｒ ｄ ｉ ｘ 和Ｃ ｅ ｒ ｖ ｅ ｒ ． ｔ ｅ ｘ已 上 市 ６ 年， 二 者 均包 含 ２ 个 ＨＰ Ｖ高 危 型 别 １ ６ 和 １ ８ ， 能预防约 ７ ０ ％的 宫 颈 癌 ， 结 果 令 人 振 奋 。 。 然 而， 由于多 种 原 因 ， 治疗 性 疫 苗研 究 进 展 相对 缓 慢 。
同 的联合 免 疫 模 式免 疫 动 物 ， 观 察 其 在 动 物 体 内 诱
发 的抗 肿瘤 免疫 应答及 抑 制肿瘤 生长 效果 。
体对 Ｈ Ｐ Ｖ免 疫 反应 之 间 的这 种 密切 关 系 ， 使得 人 们
考 虑 用疫 苗 免 疫 的策 略 来预 防 和治 疗 Ｈ Ｐ Ｖ的感染 ， 从 而 进 一 步 达 到 预 防 和 治 疗 宫 颈 癌 及 宫 颈 癌 前 病 变
司； Ｃ Ｍ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ ｔ ｍ Ｆ ａ ｓ ｔ Ｆ ｌ ｏ ｗ介 质 购 自 Ａ ｍ ｅ ｒ ｓ ｈ ａ ｍ
Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｉ ａ 公司。
１ ． ２ 重 组 腺 病 毒 疫 苗 的 扩 增
取重组病毒单斑株冻存 液约 ０ ． １ ｍ Ｌ， 与 １ ｍＬ 含２ ％胎 牛 血 清 的 Ｄ ＭＥ Ｍ混 合 后 感 染 长 至 ６ ０ ％一 ７ ０ ％ 的２ ９ ３细 胞 ， ３ ７ ℃孵 育 ２ ｈ ， 补加含 ２ ％ 胎 牛 血 清 的
Ｄ ＭＥ Ｍ维持液 ５ ｍ Ｌ， 至 绝 大 部 分 细 胞 出 现 细 胞 肿
胀、 圆缩 等 典 型 病 变 后 收 集 细 胞 ， 悬于Ｐ Ｂ Ｓ中 ， 一 ７ ０ ℃ 冻融 ３ 次， 测 量病 毒 滴 度 ， 按 １ ｐ ｆ ｕ ／ １ ０ 个 细 胞 的 病 毒 感染剂量接种 ２ ９ ３细 胞 进 行 扩 增 ， 并 超 速 离 心 纯 化 病 毒 至 获 得 所 需 滴 度 的 重 组 病 毒 量 。
１ ． ４ ＨＰ Ｖ１ ６ Ｌ ２ Ｅ７ Ｅ ６融 合 蛋 白 疫 苗 的 制 备
将 本 室 保 存 的含 重 组 表 达 质 粒 ｐ Ｅ Ｔ Ｈ Ｐ Ｖ１ ６ Ｌ ２ Ｅ ７ Ｅ ６的 大 肠 杆 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 菌株按 ｌ ： １ ０ ０的 比
用 疫 苗 时会 产 生 免疫 耐 受 ， 而对 于 重 组病 毒 载 体 免
疫 时所 产生 的载体抗 体 ， 会 中和 重复 免疫 的病 毒 ， 从 例 接 种 于 ２ ０ ０ ｍＬ Ｌ Ｂ（ Ｋ ａ ｎ ） 培养 液 中 ， ３ ７ Ｃ Ｃ 培 养 至 而 减 弱 病 毒 疫 苗 的 效 果 “ 。 同时 ， 由 于 在 临 床 上 经 Ｄ 值为０ ． ８ ， 加 终 浓度 为 ０ ． ８ ｍｇ ／ ｍ Ｌ的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ于 ２ ０ ｃ 【 ＝ 历 了手 术 、 放 疗 和化 疗 的宫 颈癌 病 人 的机 体 免 疫 系 诱 导 表 达 １ ６ ｈ ， 离 心 收 集 细菌 ， 加裂解液（ ５ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／