海洋硫酸多糖类药物聚甘古酯单克隆抗体的制备及其特性研究_cropped

海洋硫酸多糖类药物聚甘古酯单克隆抗体的制备及其特性研究
1
, 辛现良1 , 耿美玉
1 3
, 朱建春2 , 杨 明2 , 李 勇2
陈
(1. 青岛海洋大学 药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003 ; 2. 长春生物制品研究所 血液制品研究室 , 吉林 长春 130012)
摘要 : 目的 制备和纯化聚甘古酯 (911) 单克隆抗体 ,为 911 药代动力学的免疫学方法的建立提供依据 。

方法
用还原胺化法 ,制备 9112BS A 和 9112HS A 复合物 ,间接 E L I S A 法检测抗体生成 。

以 Isostrip T M
试剂盒测定抗体亚型 ,流
式细胞仪测定 DNA 含量 。

结果 获得了一株阳性杂交瘤细胞 DD3 ,腹水效价可达 1 ×105
,其抗体亚型为 IgG 2a (κ) , 细胞株的 DNA 含量约为脾细胞和 NS 21 细胞之和 ,亲和力常数为 210 ×108 L 〃m ol - 1。

结论 本实验制备了特异性针 对 911 的单克隆抗体 DD3 ,且与内源性多糖和褐藻酸无交叉反应 ,为 911 药代动力学的免疫学检测提供了依据 。

关键词 : 海洋硫酸多糖 ; 聚甘古酯 ; 单克隆抗体 ; 抗艾滋病药物 文章编号 : 0513 - 4870 (2003) 01 - 0023 - 04
中图分类号 : R 967
文献标识码 : A
Prep aration and characterization of m onoclonal antibody aga i nst m arine
sulfated polysaccharid e d rug poly 2m annaguluronic acid
CHE N Kun 1
, XI N X ian 2liang 1
, GEN G Mei 2yu 1
, ZH U J ian 2chun 2
, Y AN G Ming 2
, L I Y ong
2
( 1 . Marine Drug and F ood Institute , Ocean University o f Qingdao , Qingdao 266003 , C hina ;
2 . Biologics Institute o f Changchun , Changchun 130012 , C hina )
Abstract : Aim T o prepare and characteriz e the m onocl onal antibody against poly 2m annaguluronic acid
(911) . M ethod s A hybridom a cell line was obtained by cl oning for 3 tim es those cells that secret antibody against 911 after the fusi on of NS 21 m yel om e cells with spleen cells from Balb Πc m ice imm unized with a 9112 bovine serum albumin conjugate , prepared by reductive aminati on. Hybridom a was inoculated to Balb Πc m ouse to induce ascites. The antibody was puri fied by amm onium sul fate and Protein A - Sepharose C L 24B . DD3 was confirm ed to be fusi on cells after determinati on of DNA content with fl ow cytom etry. C om petitive inhibitory test and Biacore confirmed the cross 2reactivity of the antibody with other endogenous polysaccharides or with alginic acid sodium. Igs ′classes and subclasses were identi fied by Isostrip TM
m ethod. The affinity of DD3 was verified by E L IS A. Results A hybridom a cell line secreting m onocl onal antibody against 911 (m arine sul fate polysaccharide ) named DD3 was obtained. The DD3 ascites contained speci fic antibody with titer over 110 × 105
. There was no cross 2reactivity of these antibodies with other endogenous polysaccharides or with alginic acid sodium. The imm unogl obulin subclass of DD3 was IgG 2a ,κ type . The affinity of DD3 was 210 ×108
L 〃m ol - 1
. Conclusion One hybirdom a line (DD3) secreting m onocl onal antibody against 911 was established to provide a potential m ethod for the pharm acokinetic study of 911 .
K ey w or ds : m arine sul fated polysaccharide ; poly 2m annaguluronic acid ; m onocl onal antibody ; anti 2AIDs agent
多糖有抗凝血 、抗病毒 、抗氧化 、神经营养和保
护等多种生物学活性 。

因此多糖的药物学研究备受 关注1 。

但是由于多糖化学结构复杂 ,没有特征的
紫外吸收 ,因此目前缺乏一种微量定量的 、特异性强 的体内检测方法 。

目前常用的同位素标记法 、高效 液相色谱法和生物学测定法等 都 有 一 些 缺 陷 和 不
收稿日期 : 2002203208 .
基金项目 : 国家自然科学基金重点项目 ( 30130200) ; 国家自然
科学基金资助项目 (300700694) .
3
通讯作者 Tel : 86 - 532 - 2032066 , Fax : 86 - 532 - 2032054 ,
E 2mail : ya olishi @ouqd. edu. cn
足 。

免疫学方法因其特异性好 、灵敏度高 ,越来越广 泛的应用于药代动力学研究 。

免疫学方法应用的关 键是要得到特异性好 、亲和力高的抗体 ,抗体的性质 直接决定免疫学方法应用的成功与否 。

聚甘古酯 ( 911) 是 本 所 研 制 开 发 的 一 种 国 家 I 类抗艾 滋 病 新 药 , 属 于 海 洋 硫 酸 多 糖 类 物 质 。

911 可以通过免疫调节和抑制病毒复制等多途径发挥抗 艾滋病作用 。

有疗效确切 、副作用小等优点 ,现已进 入 II 期临床研究2 。

本文旨在以 911 单克隆抗体的 制备为切入点 ,通过对其抗体特性的研究 ,为糖类物 质单克隆抗体的制备提供方法依据 ,进而为糖类物 质药代动力学的免疫方法的建 立 提 供 源 头 物 质 基 础 。

胞与 NS 21 细胞混合 (5∶1) ,在 50 % PEG 中融合 。

融 合细胞在含 2 % H AT 的 RP MI 21640 培养液中培养 7
～14 d ,以 9112HS A 复合物为抗原 ,用间接 E L IS A 方 法筛选分泌抗体的杂交细胞株 。

阳性孔细胞用有限 稀释法进行克隆化 ,选择单细胞孔的克隆上清液以 间接 E L IS A 法筛选阳性克隆 ,经 3 次克隆化直至抗
体分泌阳性率为 100 % 。

选择 抗 体 反 应 强 、生 长 良 好的杂交瘤细胞克隆 (DD3) 扩大培养并及时液氮冻 存 。

间接 E L I SA 法检测抗 911 的抗体 分别使 用
911 和 9112HS A 共 价 复 合 物 为 抗 原 包 被 酶 标 板 , 每
孔 10 μg ,4 ‴过夜 。

用含 2 %HS A 的 PBS 缓冲液封 闭 ,其余按常规方法进行 。

A 值为阴性对照 211 倍
者为阳性 。

将阳性血清倍比稀释后 , E L IS A 法测定
抗体反应 ,比较不同抗原包被方法的灵敏度 。

对于 融合初期的细胞培养上清液采用 9112HS A 共价复合 物为抗原检测 ,其余样品均使用 911 为抗原检测 。

材料与方法
实验动物和仪器药品 聚甘古酯 ( 911) 为本所 自制 , 批 号 : 950601 , 平 均 分 子 量 为 6 000 u ; RP MI 2 1640 购自 G ibco 公司 ; 聚乙二醇 (polyethylene glycol ,
PEG ) 购 自 Merck 公 司 ; 降 植 烷 (pristane ) 、碘 化 吡 啶
( P I ) 、褐藻酸 (alginic acid ) 、硫酸软骨素 A ( c hondroitin sul fate A ,CS A ) 、硫 酸 软 骨 素 C ( c hondroitin sul fate C , C SC ) 、硫酸肝素 ( heparin sul fate , HS ) 均购自 Sigm a 公
司 ; I sostrip T M
试剂盒购自美国罗氏集团 ; p rotein A 柱
( H iT rap TM rProtein A FF ) 、生 物 大 分 子 相 互 作 用 仪 ,
Biacore X 型 ,均购自 Am ersham Pharm acia 公司 。

流式
细胞仪 ,V antage 型 ,美国 Becton Dickinson 公司生产 。

Balb ΠC 小鼠 , ♀,8 周龄 , 购 自 山 东 医 科 大 学 实 验 动 物中心 。

NS 21 细胞 ,长春生物制品研究所李勇研究 员惠赠 。

5 腹水的制备及纯 化 Balb ΠC 小 鼠 每 只 ip 降
植烷 015 m L ,1 周后腹腔接种杂交瘤细胞 1 ×106
,待
小鼠腹部膨大后抽取腹水 。

将腹水在 4 ‴下 4 500
- 1
r 〃min 离心 30 min ,取上清液 ,用 0122μm 滤膜过滤
后 ,用饱和硫酸铵法初步纯化 。

沉淀用 protein 2A 亲
和柱色 谱 继 续 纯 化 , 011 m ol 〃L - 1
柠 檬 酸 钠 缓 冲 液 (p H 415) 洗脱 ,紫外 280 nm 监测 ,收集蛋白流出液 , 立即用 p H 810 Tris 2HCl 缓冲液中和 。

蒸馏水 4 ‴透 析过夜后冻干 。

T M
免疫球蛋白( I g) 类及亚类鉴定 使用 Isostrip 试剂盒 ,按试剂盒说明书操作 。

6 细胞株 D N A 含量测定 取 NS 21 ,正常脾细胞
5
抗原制备3
和杂交瘤细胞各 2 ×10 个 , PI 避光染色 30 min ,400
目滤网过滤后流式细胞仪检测 ,用相对荧光强度表 示 DNA 含量 。

用还原胺化法 , 制备 9112BS A 共
价复 合 物 和 9112HS A 共 价 复 合 物 , 将 911 , BS A 或 HS A ,NaC NBH 3 溶解于 p H 916 碳酸盐缓 冲 液 中 , 置 于 37 ‴恒温箱中反应 3 d 。

Sephadex G 2150 分离 ,紫 外 280 nm 检测 ,分别用苯酚2硫酸法和 280 nm 紫外 吸收法确定组分中 911 和蛋白含量 。

动物免疫和特异分泌抗 911 单克隆抗体的杂交 7
抗体特异性鉴定
用竞争抑制分析法 ,分别 将培 养 上 清 液 与 911 , a lginic acid , CS A , C SC , HS 混 - 1
合 ,使药品终质量浓度为 10 ,1 μg 〃m L ,37 ‴孵育 30 min 。

以生物大分子相互作用仪检测 911 抗体与 芯片表面 911 的结合情况 ,进样量均为 15μL ,流量 5
瘤建株4 将 9112BS A 共价复合物 4 m g 溶于生理 - 1
μL 〃min , 实 验 温 度 25 ‴。

反 应 完 毕 , 用 116
盐水 5 m L 中 。

与等体积的弗氏完全佐剂双推法混 匀 ,背部皮下多点注射免疫 Balb ΠC 小 鼠 , 每 只 小 鼠 抗原用量 200 μg (015 m L ) 。

1 周后用等量抗原与不 完全佐剂混匀后 ,ip 加强免疫 ,每只小鼠 200 μg (015 m L ) ,重复 3 次 ,每周 1 次 。

最后 1 次免疫 7 d 后 ,剪 尾取血 E L IS A 法测定血清抗体 。

对于抗体反应阳性 小鼠 ,每只尾 iv 抗原 100 μg ,3 d 后取免疫小鼠脾细
- 1 - 1
m ol 〃L NaCl 和 10 mm ol 〃L NaOH 混 合 液 再 生 芯 片 。

记录每次反应的响应值 ( R U ) 。

并计算不同质 量浓度的药物对各种抗体的抑制率 。

混合物响应值 ( R U )
抑制率 ( %) = 1 -
×100 %
培养上清液响应值 ( R U )
抗体亲和力测定8 将 100 μg 〃m L - 1
的 911 以 1 000倍 ,以 911 为抗原 , E L IS A 法检测抗体反应均为
阳性 。

5 免疫球蛋白( I g) 类及亚类鉴定
以 Isotrip T M 试剂盒测定的结果显示 ,DD3 细胞分
泌的抗体亚型为 IgG 2a ,轻链为κ型 。

6 细胞株 D N A 含量测定
用荧光染色方法 ,通过流式细胞仪对抗体阳性 细胞的 检 测 结 果 发 现 , 脾 细 胞 的 平 均 荧 光 强 度 为 21106 ,NS 21 细胞的平均荧光强度为 43192 ,DD3 细胞
株的平均荧光强度为 71111 。

平均荧光强度代表了
DNA 含量 。

本实验发现 DD3 细胞株的 DNA 含量均
与 NS 21 细胞和脾细胞的 DNA 含量之和相近 , 且峰 形较好 ,C V 值小于 7 % 。

说明 DD3 为杂交瘤细胞 。

7 抗体特异性鉴定
911 抗体 DD3 特异性研究结果发现 ,DD3 与 911
的抗原2抗 体 反 应 能 被 911 特 异 性 的 抑 制 , D D3 与
alginic acid , CS A , C SC , Heparin 和 HS 均 无 交 叉 反 应
(表 1) 。

原倍 ,1∶2和1∶4 3 种倍比稀释度包板 ,次日封板后 ,
将纯化的 DD3 抗体用 PBS 配成 1 ×10 - 6 ,1 ×10 - 7
,1
×10 - 8
, 1 ×10 - 9
和 1 ×10
- 10
m ol 〃L
- 1
的 溶 液 , 间 接
E L IS A 法测定抗体反应 ,计算抗体亲和力常数 。

结果
1 抗原制备
用苯 酚2硫 酸 法 测 定 911 质 量 浓 度 在 0113 ～
2100 g 〃L - 1
与 490 nm 处 吸 光 度 值 呈 良 好 的 线 性 关 系 ,回归 方 程 为 Y = 014392 X + 011038 , r = 019991 ; BS A 和 HS A 溶液在 280 nm 处吸光度值与质量浓度
在 0113 ～2100 g 〃L - 1
呈良好的线性关系 , 回归方程
分别 为 Y = 015859 X + 01019 和 Y = 015527 X + 010188 , r 值分别为 110000 和 019996 。

BS A 2911 复合 物硫酸2苯酚法显色吸光度值为 012264 ,280 nm 的吸 光度值为 018203 ,以回归方程计算 911 质量浓度为
0125 g 〃L
- 1
,BS A 质量浓度为 1137 g 〃L
- 1
,911 与 BS A
的质量比约为 1∶5 。

HS A 2911 复合物硫酸2苯酚法显 色 吸 光 度 值 为 012549 , 280 nm 的 吸 光 度 值 为
016946 , 以 回 归 方 程 计 算 911 质 量 浓 度 为 0132 g 〃L
- 1
, HS A 质量浓度为 1122 g 〃L
- 1
,911 与 HS A 的质
量比约为 3∶10 。

Dose 2response inhibition f or c haracteriza 2
T a b le 1
tion of the DD3 bin ding aff i nity to poly 2m annagulu 2
ronic acid ( 911) , alginic acid , c hon d roitin sulfate A ( CSA) , chon droitin sulfate C ( CSC) , H e p arin an d he p arin sulfate ( H S) 2 H S A 2911 复合物在间接 E L I SA 试验中的应用
以 911 包被的酶标板检测阳性血清时 ,血清在 C oncentration Π I nhibition Π C oncentration Π I nhibition Π
G r oup
G r oup μg 〃m L - 1 μg 〃m L - 1
% % 稀释1 000倍时反应为阳性 ; 而使用 HS A 2911 复合物 包被的酶标板检测 ,血清在稀释10 000倍后 ,抗体反 应仍为阳性 。

HS A 2911 复合物包被的酶标板可明显 提高间接 E L I S A 法检测灵敏度 。

3 动物免疫与杂交瘤细胞建株
细胞融合后 ,经过对阳性克隆的筛选和连续克 隆化 ,建立了 1 株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤 细胞系 。

杂交瘤细胞经连续培养 6 个月 ,仍保持分 泌抗体能力 ,液氮冻存复苏 3 次后生长良好 ,分泌抗 体的性能稳定 。

4 腹水的制备及纯化
小鼠腹水收集后 ,以 911 为抗原 , E L IS A 法检测
911 抗 体 效 价 。

DD3 的 腹 水 效 价 达 到 105
以 上 。

DD3 腹水 用 饱 和 硫 酸 铵 法 纯 化 后 , 沉 淀 稀 释 1 000 倍 ,以 911 为 抗 原 , E L IS A 法 检 测 抗 体 反 应 均 为 阳 性 。

DD3 腹水的饱和硫酸铵沉淀经 protein A 柱色谱 后共收集到 5 管洗脱液 ,其中前 4 管在 280 nm 处有 明 显 吸 收 。

将 4 管 洗 脱 液 分 别 用 P BS 梯 度 稀 释
911 10
1 10 1
10 88. 95 51. 21 0 0 0. 67 CSA 10
1 10 1 10 0 . 69 1 . 61 5 . 94
2 . 82 14 . 92 CSC
H S
A lginic acid
H e parin
1 0
1 6 . 94
8 抗体亲和力测定
以 DD3 不同浓度的对数值为横座标 ,以其相应
的 A 450 值为纵座标绘制出 3 条反应曲线 ,取各曲线 上部趋于平坦段的 A 值为 A 2100 ,查出其 A 250 点抗 体浓度 A b t , Ab ′t 和 Ab ″t 3 个值 , 按下列公式 计算 K 值 。

当包板抗原浓度比为 1∶2 时 , K = 1Π2{2 (Ab ′) t - (Ab ) t } 或 K = 1Π2 {2 (Ab ″
) t - ( Ab ′) t } 。

当 包被抗原浓度比为 1∶4 时 , K = 3Π2{2 (Ab ″
) t - (Ab ) t} 这样各株单抗每次测定可得 3 个 K 值 ,平均值 即为
其 亲 和 力 常 数 K a 。

DD3 的 亲 和 力 常 数 K a =
210 ×108
L 〃m ol - 1
(图 1) 。

度,又可以避免抗BS A 抗体引起的假阳性反应。

用
这种改良的E L IS A 法可以检测到融合初期的抗体分
泌,指导克隆和放大培养的工作。

为了避免HS A2
911 复合物和911 之间的结构差异引起的假阳性反
应,在放大培养后依然用911 为抗原检测抗体。

本文制备了特异性针对海洋硫酸多糖类新药
911 的单克隆抗体DD3 ,经911 阻断试验及竞争性抑
制试验证明此单克隆抗体对911 有特异性反应,而
且与内源性多糖无交叉反应。

为911 药代动力学的
免疫学检测建立提供了物质来源。

◆—◆100 μg〃m ol - 1 911 ; ■—■50 μg〃m ol - 1 911 ; ▲—▲25
μg〃m ol - 1 911
Figure 1 R esponse curves of the DD3 to di fferent R eferences :
coated concentrati on of poly2m annaguluronic acid
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(911)in E L I S A
讨论
单克隆抗体具有绝对的纯一性,其特异性和亲和力优于多克隆抗体。

目前已广泛用于免疫学、微生物学、医学及生物学等领域。

制备单克隆抗体时, 杂交技术操作过程中的影响因素甚多,特别是多糖类等半抗原物质,在获得良好的免疫应答和融合细胞的抗体阳性率方面,其难度大大超过蛋白质或颗粒类抗原。

911 作为海洋硫酸多糖类物质,分子量小,且为直链结构,免疫原性差,无法诱导抗体产生。

为了制备其特异性抗体,作者借助弱抗原抗体制备的方法, 将911 与BS A 通过化学方法连接,以增强其免疫原性,在反应过程中,用还原胺化法,将911 端基的缩醛结构打开,使之与BS A 的氨基相连,尽量保持911 的原有构象。

以此复合物为抗原免疫BalbΠC 小鼠, 可以诱生针对911 的抗体。

经BS A2911 复合物免疫的BalbΠC 小鼠脾细胞与NS21 骨髓瘤细胞融合, 经过E L I S A 筛选、有限稀释法克隆,建立了4 株分泌911 抗体的杂交瘤细胞。

在细胞融合初期,抗体分泌量极低,用通常的E L IS A 方法无法检测到抗体。

放射免疫法虽然可以提高检测灵敏度,但是该法有可能对操作者存在不利影响。

在许多半抗原的抗体检测中,将半抗原与蛋白质连接后铺板,可以提高E L IS A 法的灵敏度9 。

因此在本试验中又制备了HS A2911 复合物,以此复合物为抗原包被酶标板, 既可以明显提高E L IS A 法的灵敏
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