基因芯片筛选新疆哈萨克族食管癌与癌旁正常组织间差异表达miRNA及其功能验证

第50卷第10期2020年10月
新疆医学
XINJIANG MEDICAL JO U R N A L
V〇1.50 N o.10
October.2020
新疆医学会健康管理学专业委员会常务委员：王淑霞，女，主任医师，副教授，硕士研究生
导师，健康管理专家，新疆医科大学健康管理院副院长C
现任新疆医学会健康管理学专业委员会常务委员兼秘书，国家卫生职业技能健康管理师师
资，中华医学会健康管理学分会隄性病管理学组委员，中国健康管理协会互联网健康管理分会副
秘书长，自治区健康管理(体检）质量控制中心副主任，新疆医学会健康管理学专业委员会体检评
估与信息学组副组长，中国研究型医院整合医学专北委员会委员，新疆包虫病学会常务理事，新
疆营养学会理事，《中华健康管理学杂志》通讯编委3
致力于健康管理(体检)工作丨〇余年，在健康科普、行业质控和服务品牌建设方面具备丰富的
创新实践经验;主持及参与各级科研项目丨8项，发表论文50余篇，主编、副主编著作6部;从事高
等教育25年，副主编《健康服务与管理技能》国家高等院校“十三五规划”教材丨部，编写健康管理学教学、实习及考试大纲;承办国家级、自治区级继续教育项目10余项。

参与荣获“中华医学科技奖医学科普奖V‘新疆维吾尔自治区第二届科学技术普及奖”及“中国老年保健医学研究会科技进步三等奖”等，以及荣获全国手拉手”健康管理社区行一城市社区全
科医师公益性培训先进个人奖、全国“自我健康管理优秀奖”、新疆维吾尔自治区及乌鲁木齐市全民健康体检工作先进个人等
•专题研究•
基因芯片筛选新疆哈萨克族食管癌与癌旁正常
组织间差异表达miRNA及其功能验证
刘涛1_2,王淑霞“2,卢晓梅、王育珊s苏银霞s姚华2
(1新疆医科大学第一附厲医院,2新疆医科大学健康管理院，乌鲁木齐,830054 >
摘要：目的基因芯片筛选新疆哈萨克族食管癌组织和癌旁正常组织差异表达m iR N A及其功能验证，为进一步研究m iRNAs在食管癌发生发展中的作用机制提供理论依据。

方法收集6对新疆哈萨克族食管癌患者癌组织及癌旁正常组织，m iRNA微阵列芯片分析食管癌组织及癌旁正常组织的差异m iR N A,实时荧光定量P C R验证m iR-155在食管癌组织及癌旁组织中的表达，并在细胞水平上采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法、细胞划痕、和细胞周期实验验证其与食管癌恶性表型的相关性。

结果与癌旁正常组织相比，共筛选出差异miRNA 69个，其中包括上调miRNA 56个，下调miRNA13个...并对筛选出的上调基因m iR-155进行实时荧光定量P C R验证和细胞功能验证，m iR-155在癌组织中表达明显高于癌旁组织，与芯片结果一致；并且在细胞水平上促进了食管癌细胞增殖、迁移，阻值食管癌细胞于S期，结论基因芯片筛选并验证了ra iR-155参与了食管癌的恶性表型。

关键词：基因芯片；miRNA;食管癌
中图分类号：R735.1文献标识码:A 文章编号：1001—5183(2020)10—1005—05
Screening of differentially expressed miRNA between esophageal carcinoma and para-carcinoma normal tissues of Kazak ethnic group of Xinjiang and its functional verification
LIU Taol-2,WANG ShuxiaL2,LU Xiaomei1,WANG YushanK2,SU Yinxia1-2,YAO Hua:
('The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi. 830054, China;
:Health Management Institute. Xinjiang Medical University, IJrumqi, 830054, China)
Abstract: Objective To screen differentially expressed miRNA and its functional verification in esophageal cancer tissues and adjacent normal tissues of Kazak ethnic group of Xinjiang and provide theoretical basis for further research on the mechanism of miRNAs
基金项目：国家A然科学基金(项目编号:81860510),省部共建国家重点实验室幵放课题(项目编号:SKL-HIDCA-2017-Y9)。

作者简介:刘涛，男，硕士，助理研究员，研究方向：肿瘤早筛及其健康管理
通信作者:姚华，男，博士，教授，主任医师，研究方向:健康管理，E-mail:535052988@
1006新疆医学第50卷
in the (levelof)ment of esophageal cancer. Methods Six pairs of cancer tissues and adjacent normal tissues of Kazakh patients with esophageal cancer in Xinjiajig were collerted. MiRNA microarray was used to analyze the differential miRNAs between esophageal cancer tissues and nonnal adjacent tissues. Real time quantitative PCR was used lo verify the expression of miR-155 in esophageal cancer tissues and adjacent nomial tissues. At the c ellular level, the correlation between the expression and the malignant phenotype of esophageal cancer was verified hy MTT, cell scratch test and cell cycle test. Results A total of 69 miRNAs were screened out, including 56 up-regulated miRNAs and 3 down regulated miRNAs. The results showed that the expression of miR-155 in cancer tissues was signifirantly higher than that of adjacent tissues, which was consistent with the m ic roarray results. Moreover, miR-155 promoted the proliferation and migration of esophageal cancer cells at the cellular level, and prevented the esophageal cancer cells in S phase. Conclusions miR-155 is involved in the malignant phenotype of esophageal rancer.
Key w ords：Gene Chip; miRjNA: Esophageal Canrer
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病 率和死亡率分别位居恶性肿瘤第六位和第四位
已成为威胁生命健康的重大杀手，晚期食管鱗癌在 5年内生存率仍低于丨5%IM。

mirmRNA(简称miRNA)是一类非编码小分子RNA,长约21-24 个核苷酸(n t)，能够调控靶基因的表达从而影响靶 基因的功能，参与细胞增殖、迁移、凋亡等多种病理 过程^1。

部分miRNA表达失控与肿瘤发生密切相 关,引起相关的軍:要信号通路组成的调控网络发生 异常，从而促进肿瘤的发生或进展〜1。

因此，研究 肿瘤发生相关miRNA的表达及功能是当今肿瘤发 生机制研究热点之一。

本研究基于芯片技术筛选出 食管癌发生发展相关miRNA,选取在癌组织中高 表达miR-155扩大样本量进一步验证，并探讨其 在食管癌细胞中的功能，为进一步研究食管癌的发 生发展提供理论依据。

1材料与方法
1.1材料
收集2013-2014年新疆医科大学第一附属医 院住院患者手术切除的新鲜食管癌组织及癌旁正 常组织3()对，所有患者术前均未接受过任何系统 的放疗、化疗等相关治疗，通过新疆医科大学第一 附属医院伦理委员会伦理审查，并签署患者家属知 情同意书。

miRNA表达谱基闵芯片为由北京博奥 生物有限公司提供的Agilent基因芯片。

食管癌细 胞系E A706均由本实验室保存。

细胞培养胎牛血 清、RPMI-1640培养基、胰蛋A酶等购自美国Gihro 公司，荧光定量PC R试剂盒购日本Takara公司，四甲基偶氮唑盐MTT及细胞周期/凋亡试剂盒购 自美国Invitrogen公司。

1.2基因芯片筛选差异miRNA
选取6对食管癌组织及其对应癌旁组织，提取 总RN A后进行基因制备，随后芯片杂交，扫描，应 用 miRNA 芯片分析系统（AgilentFeature Extraction vlO.7,Agilent Gene Spring 软件）P-value 方法对基 因芯片杂交结果进行分析，筛选差异miRNA。

1.3实时荧光定量P C R验证miR-155在食管癌组 织及癌旁组织中的表达
另取30对新鲜食管癌组织及其癌旁组织提取 总RNA,按照P C R反转录试剂盒说明书获得rDNA。

以U6为内参，采用实时荧光定量PC R对芯 片高表达miR-155进行验证。

1.4细胞培养、转染
复苏食管癌细胞株E(_9706至含有10%胎牛血 清的1640培养液中，置于37t、5%C02细胞培养 箱中培养。

待细胞铺满培养瓶底部后，取对数生长 期细胞，消化传代接种至6孔板中，调整细胞密度 至3 x 10V孔，按Lipofertamine3000说明书，分别转 miR-155 minics,inhibitor,negative controK NC)〇1.5 M T T法（四曱基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞增殖
取对数生长期细胞，调整细胞密度按1.5 x 10V 孔接种至％孔板中，每组设3个复孔，分别转染 miR-155 minics,inhibitor,和 NC，于 24 h、48 h、72 h、96 h后，按20 pi/孔加人MTT溶液.37T 5% C02恒温培养箱孵育4 h后，弃去上清液，每孔再加 入二甲基亚砜180^1.,微型振荡器上振荡lOmin,使之充分溶解混匀，用酶标仪检测各组细胞的吸光 度值(490 nin),并绘制细胞生长曲线。

1.6细胞划痕实验
第10期刘涛，等；基因芯片筛选新隳哈萨克族食管癌与癌旁正常绍织间差异表达m iR N A及其功能验证1007
取对数生长期细胞，调整细胞浓度按5 x 105/
孔接种6孔板，待第二天细胞铺至6孔板底面积
70%时，用IO jjl L无菌枪头划痕，再用PBS润洗2
遍，弃去上清培养液，换成新鲜低血清培养液培养，
分别于转染前及各组转染后24h、48h、72h、96h
时在倒置显微镜下观察划痕愈合距离并拍照3
1.7细胞周期：
消化食管癌细胞株Era109，无水乙醇41冰箱
固定过夜，按照细胞周期试剂盒说明书加人P I染 色后，上流式细胞仪检测各组细胞分别在G1期、G2期和S期各期时相的百分比，分别取各组平均 值进行统计学处理。

1.8统计学分析
所得数据用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差U±s)表示，多组之间 比较采用单因素方差分析，以P<〇.〇5为差异有统 计学意义。

2结果
2.1基因芯片筛选的差异表达miRNAs
采用Agilent Gene Spring软件分析6对新疆哈 萨克族食管癌组织及其癌旁正常组织中差异miRNA(图1)。

共筛选出56个上调miRNA和13 个下调miRNA (表1)。

2.2实时荧光定量P C R检测miR-155在食管癌组 织及癌旁组织中的表达
实时荧光定量PC K检测30对食管癌组织及 癌旁组织中miR-155的表达，用U6作为内参，结 果采用法进行分析，结果显示：miR-155在 食管癌组织中表达明显高于与其对应的癌旁组织，趋势与基因芯片结果一致（图2)。

2.3 miR-155对食管癌细胞Ec9706增殖的影响
转染miR-155基因后，分别检测食管癌细胞 Ec9706 在 0、24、48、72、96h 在 490nm 处的吸光度 值(0D值）,绘制细胞增殖活性曲线（图3)0 h、24 h各组在490 nm波长处的0D值差异无统计学意 义（P> 0.05)，48、72、96 h 处抑制 miR-155,细胞增 殖受到明显抑制，与N C组和minics组相比，差异 有统计学意义(P>〇.〇5)。

结果表明，抑制miR-155 基因可能抑制了食管癌细胞的增殖。

图1基因芯片分析差异表达miRNA
表1食管癌及癌旁正常组织中差异表达miRNAs miRNA名称差异倍数P值上调/下调hsa-miR-7 4.1157690.004478511上调hsa-miR-3141 3.97145030.018557245上调hsa-niiR-155 3.80022050.001700819上调hsa-miR-146a 3.71737070.0034306上调hsa-miR-21* 3.3919240.000495268上调hsa-miR-18a 3.29504850.007245636上调hsa-miR-452 3.2454180.017399827上调hsa—miR—18h 3.06895350.009808923上调hsa-miR-127-3p 2.97370170.003806281上调hsa-m i R -12 7a-3p 2.69276290.012827332上调
hsa-miR-133h17.1667370.002001579下调hsn-miR-116.2260860.002904319下调hsa-miH-143*7.19577740.004180275下调hsa-miH-145 6.5855210.003125376下调hsa-miH-143 6.16508670.005303735下调
食
管
癌
旁
组
织
差
异
倍
数
图3 M T T检测miR-155转染EC9706
后细胞增殖能力变化
1008
新禮医学第50卷
2.4转染miR -155基因对Ec 9706细胞迁移能力的 影响
转染miR -155后，通过细胞划痕，检测 miR -155对细胞迁移能力的影响（图4)。

结果显示 转染 miR -155 Inhibitor 组与 contro 丨组、minics 组相 比，细胞的迁移能力明显受到抑制，差异有统计学 意义(P < 0.05)。

提示miR -155被抑制后抑制了食 管癌细胞的迁移。

Inhibitor Mimics NC Normal
图4细胞划痕实验检测miR -155转染Ec 9706后细胞迁移能力变化
2.5流式细胞术检测转染miR -155对Ecal 09细胞 周期的影响
转染 miR -155 后，miR -155 Inhibitor 组 S 期细 胞较minics 组和正常对照组均显著增减少，差异有 统计学意义(P <0.05,图5),说明抑制miR -155能够 使食管癌E f 9706阻滞在S 期,减少细胞进人M 期：
3讨论
目前，围绕食管癌的miRNA 研究已经展开，并 不断深人。

基于芯片技术和生物信息学方法的研 究，已发现了一些与食管癌关系密切的miRNAs 。

Yong Guo191等第一次应用芯片对食管癌的miRNA 表达进行研究，发现在食管鳞癌与临近组织对比中 6个miRNA 与食管鳞癌高低分化相关，4个miR - N A 食管鳞癌组织与正常食管上皮相比下调，3个 miRNA 食管鱗癌组织与正常食管上皮相比上调， 28个m iRNA 与食管鱗癌的大体分型相关， miR -103, miR -丨07高表达的食管癌的患者生存率 较低。

本研究采用微阵列miRNA 表达谱芯片研究 哈萨克族食管癌发现56个miRNA 上调，13个 miRNA 下调，其与病理参数的相关性有待进一步 扩大样本量进行验证。

miR -155定位于人染色体21q 21,在B IC 基因第3个外显子高度保守区编码。

研究报道miR -155
参与多种病理、生理过程，包括炎症反应，免疫反 应，细胞增值与分化，病毒感染、心血管疾病等，与 多种肿瘤（如肺癌，乳腺癌、胃癌、胆管癌)|H W 31的发 生发展有重要关系，在调节肿瘤侵袭和转移中扮演 着重要角色，但起促癌作用还是抑癌作用报道并不 一致。

前期有研究表明，在头颈部鱗癌中，血液中 miR -146a 和mm -155的含量下降与头颈部鳞癌的 远处转移有关，提示机体中miRNA 的表达变化与
图5 EC 9706细胞转染miR -155后检测细胞周期
A :lnhibitorS
B : Mimics 组
C : Normal 组
D :N C
组
第10期刘涛，等；基因芯片筛选新疆哈萨克族食管癌与癌旁正常组织间差异表达miRNA及其功能验证1009
癌细胞的转移具有相关性||41。

在消化道胃癌组织中，miR-155表达较癌旁组织明显上调，并且与浸润和 淋巴结转移密切相关，但与患者预后不相关[12]。

Zhang J等％的研究表明，miR-155在食管鱗癌组织 中的表达明显增高，可通过直接调节肿瘤蛋白P53 诱导核蛋白1促进食管癌细胞的增殖，提示 miR-155可能参与食管癌发展进程并扮演重要角 色。

而Dorsett等％研究发现，高表达的miR-155通 过抑制 AID(activation—induced cytidinedeaminase)来起到抑癌的作用。

本研究通过微阵列miRNA表 达谱芯片筛选出miR-155在食管癌组织中上调，为验证其在食管癌中的作用,进一步扩大样本量发 现miR-155在食管癌组织中高表达，其结果与芯 片结果一致。

在细胞水平上，体外合成miR-155模 拟物，抑制剂等，采用脂质体转染食管癌细胞Ec9706，分别从细胞增殖，细胞迁移，细胞周期等方 面探究miR-155对食管癌细胞恶性表型的生物学 影响。

证实miR-155能够明显促进食管癌Ec9706 细胞的侵袭转移，这为后续深人研究在食管癌发生 发展中miR-155的作用机制提供基础，并且为 miR-155的食管癌基因治疗提供新的策略。

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[收稿日期:2020~04-02]
(本文编辑:菲拉）。