双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平

双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α mRNA表达水平姚霜;郑璐;于洋;喻妙梅;潘丽莉;张俊;冯悦华;罗光华
【摘要】目的:建立单管检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和内参GAPDH mRNA表达水平的双重荧光实时定量PCR方法.方法:脂多糖刺激小鼠巨噬细胞Ana-1后提取细胞RNA,经反转录合成cDNA,应用自行设计的不同荧光标记的TNF-α和GAPDH引物探针,经PCR扩增后,在FAM通道和CY5通道分别读取Ct值,同时应用基因测序技术对结果进行验证,并构建质粒标准品分析该方法的灵敏度和重复性.结果:双重荧光实时定量PCR法检测TNF-α的灵敏度达4×101拷贝/μL,检测线性范围可达6个数量级,批内和批间重复性好.结论:新方法消除了目的基因与内参的加样误差,节约成本,快速准确,适用于TNF-α mRNA的定量检测.
【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2015(025)006
【总页数】4页(P524-527)
【关键词】双重荧光定量PCR;肿瘤坏死因子-α;GAPDH
【作者】姚霜;郑璐;于洋;喻妙梅;潘丽莉;张俊;冯悦华;罗光华
【作者单位】苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003;苏州大学附属第三医院综合实验室,江苏常州213003
【正文语种】中文
【中图分类】R393
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞和炎性细胞，经致炎因素刺激后能够产生炎症因子，调控炎症反应［1］。

脂多糖是革兰阴性菌细胞壁的重要成分，是诱导机体产生炎症反应的关键物质，通过脂多糖刺激巨噬细胞产生促炎因子建立体外炎症模型，常用于某些潜在抗炎因子（如载脂蛋白M等）或药物作用机制的研究［2］。

炎症
模型建立的成功与否主要通过细胞产生的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor a1pha，TNF-α），白细胞介素-1β（inter1eukin-1 beta，IL-1β）等炎症因子的变化水平来衡量，因此，不断探索和改进这些炎症因子mRNA表达水平的PCR检测方法十分必要。

本实验以TNF-α为例，以双重荧光实时定量PCR方法
代替传统的单重荧光PCR，消除了多管反应体系造成的加样误差，操作简便，准
确快捷，现报告如下。

1.1 材料
小鼠巨噬细胞株Ana-1购于中国科学院上海细胞库。

脂多糖（Sigma公司）。

RNA提取试剂盒购于上海博彩生物科技公司，反转录试剂盒（TheroFish公司），PCR热启动酶及其反应体系（Bio1ine公司），LightCyc1er荧光定量PCR仪（Roche公司）。

1.2 体外炎症模型的建立
1×106个/mL的Ana-1细胞铺6孔板，3 h后加入10 μg/mL的脂多糖，6 h后提取细胞RNA。

1.3 细胞RNA的提取及反转录
按照RNA提取试剂盒和反转录试剂盒说明书进行操作。

1.4 引物及探针的设计和合成
根据NCBI数据库中小鼠TNF-α和GAPDH的基因序列，应用Primer Premier 5.0软件设计正、反义引物和探针，引物和探针均由上海生工公司合成和修饰，见表1。

1.5 实时荧光PCR
总反应体系为25 μL，包括cDNA模板2 μL，50 mmo1/L MgC12溶液1.5 μL，IMMOLASE DNA热启动酶0.2 μL，100 μmo1/L TNF-α及GAPDH正、反义引物和探针均为0.04 μL，40 mmo1/L 4×dNTP 1 μL，10×缓冲液2.5 μL，双蒸水补足至25 μL。

循环参数：95℃预变性10 min；95℃5 s，60℃27 s（温度转换
率为4.4℃/s），共40个循环，60℃收集荧光数据。

反应在LightCyc1er 480Ⅱ
型荧光定量PCR扩增仪上进行。

1.6 质粒载体构建
分别构建TNF-α及GAPDH的载体，扩增产物片段送上海生工公司克隆并测序。

1.7 灵敏度和检测范围
分别选取TNF-α和GAPDH载体作为模板，经10倍梯度稀释（4×101～
4×106），按上述条件进行荧光定量RT-PCR。

1.8 统计学分析
应用GraphPad Prism 5.0对数据进行统计学分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 结果判断
TNF-α在FAM通道出现明显“S”形扩增曲线，在CY5通道无扩增；GAPDH在CY5通道出现明显“S”形扩增曲线，在FAM通道无扩增，分别读取Ct值。

2.2 准确性分析
选取TNF-α和GAPDH的样本各一份送至上海生工公司测序，经BLAST比对后，RT-PCR结果与测序结果一致。

测序图如图1。

2.3 标准曲线的建立及灵敏度检测
该法检测TNF-α和GAPDH的灵敏度均为4×101拷贝/μL，TNF-α标准曲线的
方程为Y= -3.566X+42.60，r2=0.988，扩增效率为91％。

GAPDH标准曲线的
方程为Y=-3.541X+38.57，r2=0.996，扩增效率为92％。

其中Y代表Ct值，X 代表模板量的对数值。

其线性范围可达6个数量级（图2和图3）。

2.4 批间重复性
将4×106拷贝/μL的TNF-α和GAPDH混合作为标准品原液进行10倍梯度稀释，批内设置3个复孔，批间重复检测3次，批内和批间变异系数小于3.53％。

见表
2和表3。

2.5 脂多糖刺激Ana-1细胞前后TNF-α mRNA表达的差异
双荧光通道RT-PCR结果显示，脂多糖处理后Ana-1细胞表达TNF-α mRNA显
著高于对照组（t= 21.20，P＜0.01），差异有统计学意义。

见图4。

在炎症的发生发展过程中，巨噬细胞表面的模式识别受体可以识别多种病原相关分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar pattern，PAMP）分子启动胞内信
号传导［3］。

根据活化方式的不同巨噬细胞可以分为经典活化型（M1）和替代
活化型（M2）两种表型，脂多糖刺激后主要分化为M1a型，激活NF-κB通路表达TNF-α，IL-1β，IL-6等促炎细胞因子，而M2型巨噬细胞表达IL-10等抑炎细胞因子，降低炎症反应促进组织修复［4］。

TNF-α是维持体内免疫平衡的重要介质，在抗肿瘤、免疫防御的炎症反应中起重要的作用。

巨噬细胞经脂多糖刺激后在早期即可释放大量TNF-α，TNF-α反向作用于NF-κB通路，促进其他炎症因子
的释放，放大了炎症反应［5］。

因此，通常选取急性炎症早期细胞因子TNF-α
作为衡量炎症反应模型成功与否的标准。

多重PCR法通常用在同一反应管内检测多个基因的表达或多种病原体。

该方法缩
短了检测周期，并降低了检测费用。

传统的单重荧光定量PCR在检测多个基因时
需要多管反应体系，不但耗费试剂、样本，而且还浪费时间，较为烦琐。

在定量研究目的基因表达水平时，通常会选取GAPDH作为内参基因。

如果用单
重荧光定量PCR检测目的基因和内参基因，需要分两管进行，会在模板（cDNA）加样环节产生一个加样误差。

为避免这个误差并减少PCR次数，本研究旨在建立
一种单管快速准确检测TNF-α和GAPDH的方法，利用Primer Premier 5.0软件设计出针对TNF-α和GAPDH高度特异的引物和探针，分别用FAM和CY5荧光基团标记。

在以同一浓度阳性核酸作为模板的反应体系中，优选引物和探针的最佳浓度，根据最低Ct值选择最佳引物和探针浓度，建立最优化的反应体系。

LightCyc1er480Ⅱ型实时荧光定量PCR仪进行检测后，分别在FAM和CY5通道读取TNF-α和GAPDH的Ct值，扩增曲线为典型的“S”形。

灵敏度实验表明，检出限可达4×101拷贝/μL，无交叉反应，批内和批间重复性好，在106～101
拷贝/μL范围内具有良好的线性，可以准确测定TNF-α的表达量，为炎症模型建
立成功与否提供了一个准确、经济、快速的检测方法。

利用该方法定量检测脂多糖诱导前后Ana-1细胞TNF-α的表达，结果显示诱导组明显高于对照组，说明炎症模型建立成功。

【相关文献】
［1］ Morris MC，Gi11iam EA，Li L.Innate immune programing by endotoxin and its patho1ogica1 consequences［J］.Front Immuno1，2014，5：680
［2］ Li Y，Wu Q，Deng Y，et a1.D（-）-Sa1icin inhibits the LPS-induced inf1ammation
in RAW264.7ce11sand mouse mode1s［J］.Int Immunopharmaco1，2015，26（2）：
286-294.
［3］ Mcnab F，Mayer-Barber K，Sher A，et a1.Type I interferons in infectious disease ［J］.Nat Rev Immuno1，2015，15（2）：87-103.
［4］ Liu K，Zhao E，I1yas G，et a1.Impaired macrophage autophagy increases the immune response in obese mice by promoting proinf1ammatory macrophage
po1arization［J］.Autophagy，2015，11（2）：271-284.
［5］ Napetschnig J，Wu H.Mo1ecu1ar basis of NF-κB signa-1ing［J］.Annu Rev Biophys，2013，42：443-468.。