病毒感染实验诊断

病毒感染实验诊疗
1.（ 1 ）一般原则是特异敏感、迅速和简易。

第一依据流行病学和临床特色，初步判断可
能感染的病毒。

（2）而后依据可疑病毒的生物学特色、机体免疫应答和临床过程，以及病人目前所处的
机遇，确立实验诊疗方法。

2.
（1）对潜藏期短，发病时还没有抗体产生，可选择测定病毒颗粒、病毒抗原或核酸。

（2）对潜藏期超出十天的感染，可检测特异性的 IgM 抗体来进行早期迅速诊疗，及差别首次和
再次感染。

（3 ）对可在体内形成连续感染或潜藏感染的病毒，可检测急性期和恢复期双份血清的IgG 抗体有无 4 倍以上涨高，或直接检测病毒核酸。

（4）对原由不明或有新病毒感染时，应收集标本进行病毒分别，同时应采纳双份血清以
确认分其余病毒为病原体。

（5）对同一症状可有多种病毒惹起的状况，应同时检测几种有关病毒的病毒颗粒、抗原
或抗体。

（6）对由多个型别构成的病毒可测定它们的共同抗原。

第一节标本收集与运送
一、标本的收集
1.采样时间：尽可能在发病的早期，急性期或患者人院的当日进行。

2.标本种类的选择：依据临床感染的症状及流行病学资料，判断可能感得病毒种类，选择
相应部位采纳标本。

常有分别病毒标本的选择：
3．常有标本的收集方法
(1) 血液：以无菌取抗凝血10ml 。

抗凝采纳100n ／ ml 肝素钠。

用于分别CMV 、HSV ，、黄病毒、 EBV、 HIV-1及重生儿肠道病毒。

(2) 脑脊液：以无菌取脑脊液 1 ～ 2ml ，冰浴立刻送检。

在 4 ℃可寄存72h 。

用于分别柯萨
奇病毒、 ECHO 病毒、肠道病毒、腮腺炎病毒。

(3) 宫颈或阴道拭子：采纳病灶部位分泌物，或将拭子伸人宫颈约lcm 逗留 5 秒拿出，冰浴立刻送检。

用于分别HSV 、 CMV 。

(4)粪便标本：取 2 ～4 ｇ粪便加 10ml 运送液立刻送检，用于分别腺病毒、肠道病毒和轮状病
毒。

(5) 含漱液：用无菌生理盐水让患者含漱。

用于分别流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV 等。

(6) 喉拭子：用压舌板防止唾液污染，用拭子采纳咽喉部表面。

用于分别腺病毒、CMV 、肠道病毒、 HSV 、流感病毒等。

(7) 尿道拭子及尿液标本：尿道拭子伸人尿道4cm转动3次，以获取许多的上皮细胞，用
于分别 CMV 和 HSV 。

(8)尸检标本：死亡后尽早收集各样器官，分别使用器材和容器。

二、标本的运送和保留
1. 病毒抵挡力衰，室温中简单灭活，用于分别培育的标本要赶快送检，4℃下数ｈ或 -70 ℃。

冻存液中加入甘油或二甲基亚砜(DMSO) 等作保护。

2. 病毒传递培育基以Hanks液为基础加灭活的小牛血清。

为克制细菌生长加青霉素100U ／ml 和链霉素100 μg ／ml ，为了克制真菌的生长加入 2 ． 5 μg ／ ml 二性霉素 B 或 40 μg ／ml 制霉菌素。

第二节病毒分别与判定
一、病毒的分别方法
1.组织细胞培育依据细胞的根源、特征和传代次数分为：
(1)原代细胞培育：将细胞悬液。

加入营养液培育。

形成的单层细胞，称之为原代细胞。

(2) 二倍体细胞株：仍保持二倍体特征。

寿命一般为40 ～ 50 代，如人胚肺细胞。

宽泛用于
病毒分别和疫苗制备。

(3)传代细胞系：来于肿瘤细胞，染色体特色近似肿瘤细胞。

常用的有人宫颈癌细胞 (Hela) 、人喉上皮癌细胞 (Hep-2) 。

2 ．鸡胚接种鸡胚是用于分别粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的资料。

3 ．动物接种动物对病毒的敏感性是不一样的，选择适合动物十分重要。

小鼠、乳鼠、家兔、
豚鼠、猴等常用于分别病毒。

常用于病毒分其余细胞
二、病毒的判定：一定经过全面认识其特征才能获取判定。

1.依据临床特色，流行病学资料，标本根源，大概认识病毒的一些特征，有助于确认病毒
的种类。

2.动物感染范围及特色病毒感染动物的范围、发病的潜藏期。

3.细胞培育特色。

综合上述1/2/3资料作出判定。

4.病毒判定的方法
（1）细胞培育的结果察看：
病毒增殖后致使细胞发生：
①细胞病变效应(CPE) 。

细胞肿大，变圆聚积成葡萄状，细胞溶解出现空斑，细胞交融形成
多核巨细胞，胞浆内或核内出现嗜酸性或嗜碱性海涵体等；
②不出现细胞病变现象。

③细胞培育液pH 的变化。

（2 ）中和试验：
病毒与特异性抗体进行免疫反响，使病毒失掉感染性，在细胞培育和活的机体内不出现
病变的试验。

常用细胞培育进行中和试验。

假如特异性抗体能中和病毒，使之失掉感染性，
不出现细胞病变效应，则该病毒为特异性抗体的同型病毒。

用于病毒的分型诊疗最具敏感和正确性。

也可用于检查患者病后或人工免疫后，机体血清中抗体增添状况。

（3 ）空斑或蚀斑形成试验：
空斑是指在单层细胞中被病毒感染惹起死亡的细胞地区，四周被活细胞包围。

一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所惹起的。

不一样的病毒惹起的空斑形态和大小不一样。

可进行病毒颗粒的计数、纯化，联合中和试验可进行病毒的判定。

（4）扰乱现象：
某些病毒间存在着扰乱现象，如某些型其余鼻病毒能扰乱此后进入的副流感病毒的增
殖，进而阻抑后者的红细胞吸附作用。

（5 ）红细胞吸附及吸附克制试验：
正粘病毒，副粘病毒感染的宿主细胞，病毒增殖后产生细胞病变，但在细胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素 ) ，能吸附鸡、豚鼠或猴红细胞。

可作为初步判定。

假如在培育瓶中加入相应的血凝素抗血清后，不出现红细胞吸附现象，是为红细胞吸附克制试验阳性，可作为病毒判定的依照。

（6 ）血凝试验及血凝克制试验：
某些病毒可与必定种类的哺乳动物或禽类的红细胞产生血凝现象。

加入相应的血凝素抗体可克制血凝现象的发生，是为血凝克制试验。

可作为病毒型别确立的依照。

（7）病毒的大小及形态：可用电子显微镜察看病毒的大小及形态。

（8）核酸种类鉴识及序列测定：
利用 5 —溴 -2- 脱氧尿苷 (BUDR) 克制 DNA 复制的特征，在细胞培育液中加入该物质，
可克制 DNA病毒的复制和增殖，克制细胞病变的出现，但对RNA 病毒无克制作用，以此判断病毒核酸种类。

对病毒核酸特异序列或全序列的碱基摆列测定或DNA杂交、DNA-RNA杂交来判定病毒。

（9）耐酸试验：肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。

（10 ）乙醚敏感试验：
病毒外头若有类脂包膜，则易被乙醚损坏，而失掉感染性，不可以感染细胞。

可作为病毒
能否拥有类脂包膜的依照，也可用氯仿或去胆酸钠取代乙醚进行试验。

（11 ）免疫荧光抗体染色：
将感染细胞固定，用特异抗血清荧光标记染色，在荧光显微镜下，可见细胞内荧光，即可确立型别。

第三节病毒感染迅速诊疗
经过测定病毒的特异标记成分，如特别形态、特异的抗原成分及病毒的核酸，早期确认病毒的感染，是病毒学诊疗的重要发展。

一、形态学检查
1．光学显微镜
察看病毒感染细胞出现的海涵体。

依据特色可作出协助诊疗。

狂犬病病毒在脑细胞出现
嗜酸性的圆形或椭圆形海涵体，称为内基小体。

巨细胞病毒在上皮细胞的细胞核内出现四周
绕有一轮晕似“猫头鹰眼”样大型嗜酸性海涵体。

2．电子显微镜检查
(1)电镜直接检查：早期病毒感染标本的病毒颗粒。

如“秋天泻”患儿粪便中的轮状病毒、
甲肝患者粪便中的HAV ，疱疹病毒的疱疹液，HBV 患者血清，均可察看到特色性病毒颗粒。

(2)免疫电镜检查：在标本中加入抗体。

使病毒齐集成块负染察看，更易发现病毒体，敏
捷度可提升 100 倍。

二、病毒抗原检测：病毒抗原是病毒特异性的标记，经过免疫学技术检测标本中特异性抗
原存在，能够早期诊疗病毒感染。

1．免疫荧光技术：
适合于型别少，细胞培育难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细
胞病毒、腺病毒等。

肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的纯真疱疹病毒、脑组织中的狂
犬病毒或其余零落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。

2．酶免疫技术：
有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA) 试验法。

测定标本中游离的抗原或抗体。

如检测乙
型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg) ， HIV 感得病人的P24 抗体等。

3.其余技术：如固相放射免疫技术、发光免疫剖析技术、胶体金标记的免疫层析技术等。

三、早期抗体检测
检测病毒感染机体后产生的早期特异性抗体，如测定特异性IgM能够迅速明确诊疗各
种病毒惹起的重生儿先本性感染，测定HAV 感染后抗HAV 的 IgM抗体能够明确诊疗HA 等。

四、病毒核酸检测：只需有完好的特异基因片段存在，便可进行诊疗。

1．斑点杂交法
将待测的DNA 或 RNA 直接点在杂交滤膜上，变性后，用标记的核酸探针进行杂交。

用 32p 或 131I 同位素标记的探针经过放射白显影，可直接察看。

现用地高辛、生物素等非
同位素物质标记，而后采纳酶反响或酶免疫技术进行检测，已被愈来愈多的实验室宽泛使用。

2．固相杂交技术
将核酸探针包被聚苯乙烯微孔板中，加人待测的核酸序列和标记的指示探针杂交液中进行杂交，清洗后，用酶免疫技术进行检测。

3.原位分子杂交技术
在细胞原位裸露DNA或RNA，加入标记特异核酸探针进行杂交。

经过显色技术可显
示特定杂交探针在细胞内的地点和核酸的数目。

4.Southern印迹和Northern印迹法
Southern 印迹法用于DNA的杂交。

提取DNA, 用内切酶切割后，进行琼脂糖电泳按分子量使DNA分开，将DNA移至硝酸纤维膜上，用标记探针进行杂交。

能够检测病毒
DNA 特异序列。

Northern 印迹法用于RNA 杂交剖析。

将琼脂糖电泳后的RNA 移至 DBM 膜上，用标记探针进行杂交。

用于检测RNA 或 mRNA 。

5 ．聚合酶链反响(PCR)
(1)DNA 病毒：可直接进行 PCR 扩增其特异片段。

(2) RNA病毒：可经过RT-PCR 技术，将RNA 逆转录为cDNA ，再进行PCR 扩增。

(3)定量 PCR 技术：对扩增的产物进行原始标本定量，对病毒感染的诊疗起到了量化的作
用。

同时，对研究病毒和机体之间的关系供给了参照。

6．病毒核酸的直接检测
有些病毒如轮状病毒的核酸拥有典型的分节段特色。

能够从标本中直接提取轮状病毒的核酸。

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ，察看其独有的11 个核酸节段的条带摆列状况，进行诊疗。

五、病毒查验的结果评论
经过实验手段，从标本中获取有关病毒感染的凭证，进而确立病毒感染和临床疾病之间
的因果关系，是病毒实验诊疗的目标。

经过分别和判定获取致病性病毒，发现病毒感染的特异征象，如机体内产生特异性抗体, 急性期和恢复期血清中相应的特异性抗体有 4 倍以上的高升，细胞内海涵体的形成等,便可得出病原学诊疗。

感得病毒的临床意义一定联合流行病学资料、临床表现、病毒种类及机体的病理变化作
综合剖析，才能判断。