龙须菜对异育银鲫消化吸收、免疫及抗氧化性能的影响

龙须菜对异育银鲫消化吸收、免疫及抗氧化性能的影响
宣雄智;李文嘉;卢玉标
【摘要】本试验旨在评估龙须菜替代饲料中的菜粕对异育银鲫幼鱼消化吸收、免
疫及抗氧化性能的影响,确定龙须菜的适宜替代范围.选取健康且规格一致的异育银
鲫幼鱼450尾,随机分为6组,每组3个重复,每个重复25尾,以不含龙须菜的基础
饲料为对照组饲料,以3％(D1)、6％(D2)、9％(D3)、12％(D4)、15％ (D5)龙须菜替代菜粕配制成的饲料为试验饲料饲喂试验鱼8周,所有饲料等蛋等脂,试验结束时测定各组异育银鲫消化吸收、免疫及抗氧化相关酶活性.结果显示,与对照组相比,投喂龙须菜饲料各组异育银鲫肝脏消化酶活性无显著差异(P＜0.05);D1组异育银鲫
前肠碱性磷酸酶、肝脏超氧化物歧化酶活性,D1和D2组异育银鲫前肠γ谷氨酰转肽酶活性显著升高(P＜0.05),D5组异育银鲫前肠脂肪酶、碱性磷酸酶活性和肝脏
超氧化物歧化酶活性显著下降(P＜0.05);D1～D3组异育银鲫肾脏酸性磷酸酶活性、D2～D5组异育银鲫血清溶菌酶活性及D2、D3组异育银鲫血清总胆固醇含量和
前肠总抗氧化能力显著升高(P＜0.05),而D5组异育银鲫血清总蛋白含量显著下降(P＜0.05).综上所述,饲料中添加3％～6％的龙须菜可在一定程度上提高异育银鲫
消化吸收与免疫性能,当龙须菜替代水平达15％时,会对鱼体消化吸收和健康产生负面影响.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(045)006
【总页数】9页(P1526-1534)
【关键词】龙须菜;异育银鲫;消化吸收;免疫;抗氧化性能
【作者】宣雄智;李文嘉;卢玉标
【作者单位】苏州农业职业技术学院,苏州215008;河南省农业科学院畜牧兽医研究所,郑州450002;广东溢多利生物科技股份有限公司,珠海519060
【正文语种】中文
【中图分类】S963
饲料药物添加剂常被用于预防动物疾病、促进动物生长，然而添加剂滥用易引起动物胃肠道菌群失衡，使细菌产生耐药性。

摄食含有药物残留的畜产品会间接损害人体健康，排泄物中药物残留也易导致水体污染[1]，因此研发绿色、无毒的免疫生长促进剂成为当前动物营养研究的热点[2]。

生长在复杂海洋环境中的藻类，其代谢过程和代谢产物与陆生植物差异很大。

目前已从海藻中分离出大量具有抗菌、抗氧化、抗辐射性能的生理活性物质[3]，这些物质或可被动物体吸收，对动物消化道黏膜产生刺激，或可富集动物体内微量元素，产生特殊的生理功能，促进机体代谢，提高免疫能力[4]。

龙须菜是一种大型海洋红藻，其所含的藻胆蛋白具有抗氧化、抗畸变、提高机体免疫力和抑制肿瘤细胞生长等作用[5]，其富含的琼胶多糖是天然的饲料黏合剂和防潮剂[6]，可作为潜在的饲料原料资源。

有研究表明，在饲料中添加3%龙须菜能增加草鱼肌肉功能性脂肪酸含量，添加5%龙须菜则可促进草鱼生长，降低其血脂[7]；饲料中添加少量龙须菜对眼斑拟石首鱼的生长也有一定的促进作用，且可改善其肠道和肝脏健康[8]。

目前用大型海洋红藻龙须菜替代传统饲料原料对淡水鱼消化吸收及免疫性能的影响鲜有报道，本试验旨在研究不同水平龙须菜对异育银鲫消化吸收、免疫及抗氧化性能的影响，为龙须菜在水产饲料中的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
本试验所用的新鲜龙须菜购自福建宁德某公司。

龙须菜用海水冲洗干净后，置于户外阴干(约14 d)，尽可能保留其生物活性。

1.2 试验动物和试验设计
试验用异育银鲫苗购自珠海某种苗场。

试验开始前，先将试验鱼在室内养殖系统(试验缸规格70 cm×60 cm，200 L圆柱型养殖缸)驯化2周，驯养期间投喂对照
组饲料。

选取健康且规格一致的异育银鲫幼鱼450尾，随机分为6组，每组3个
重复，每个重复25尾。

以不含龙须菜的基础饲料为对照组饲料，以添加3%(D1)、6%(D2)、9%(D3)、12%(D4)、15%(D5)龙须菜配制成的饲料为试验饲料分别饲
喂试验鱼。

试验开始前，禁食24 h，将幼鱼用丁香酚(40 mg/L)麻醉，称体重后放入相应养殖缸中，每个重复1个鱼缸。

试验鱼初始体重为(8.2±0.1)g，试验期间采用微流水养殖，水温为(25±2)℃，pH 7.5左右；适量连续充气，使水体溶氧≥5 mg/L；每天清晨用虹吸法清除养殖缸底部的粪便，氨氮<0.01 mg/L。

每天投喂2次(08∶30、16∶30)，采用连续性饱食投喂，具体以试验鱼不再上来抢食为准，
记录投饲量。

试验期8周。

1.3 试验日粮配制
所有固体饲料原料经粉碎后过60目筛，按配方表称料并混合均匀，采用逐级扩大的方法添加维生素和矿物质等微量原料，加入约饲料干重30%的水分，拌匀后用
硬颗粒挤压机(SLP-45，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所)制成直径为1.5 mm的颗粒饲料，饲料在室温下风干，用真空包装袋密封，-20 ℃冰箱中保存待用。

不含龙须菜藻粉的饲料为对照组饲料，分别以3%、6%、9%、12%、15%龙须菜等氮替代基础饲料中的菜粕配制5组试验饲料，编号为D1～D5，饲料组成
及营养水平见表1。

表1 饲料组成及营养成分(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the diets (dry matter basis) %项目 Items对照组Control
groupD1D2D3D4D5原料 Ingredients鱼粉 Fish
meal11.0011.0011.0011.0011.0011.00豆粕 Soybean
meal17.0017.0017.0017.0017.0017.00菜粕 Rapeseed
meal30.0028.0026.0024.0022.0020.00龙须菜藻粉 Gracilaria lemaneiformis powder-3.006.009.0012.0015.00α淀粉α-
starch16.3015.3014.3013.3012.3011.30棉粕 Cottonseed
meal15.0015.0015.0015.0015.0015.00次粉 Wheat
middlings5.005.005.005.005.005.00豆油 Soybean
oil3.003.003.003.003.003.00复合矿物质 Compound
mineral0.500.500.500.500.500.50复合维生素 Compound
vitamin0.500.500.500.500.500.50氯化胆碱 Choline
chloride0.200.200.200.200.200.20磷酸二氢钙
Ca(H2PO4)21.501.501.501.501.501.50营养成分 Nutrient components粗蛋白质 CP32.6932.4632.8632.7732.1032.34粗脂肪 EE5.054.985.044.914.975.00粗灰分 Crude ash9.039.079.149.149.159.16
①龙须菜藻粉(干物质)含有：粗蛋白质18.4%，粗脂肪0.5%，粗灰分19.1%。

②复合维生素含有：维生素A 3.6×106 IU，维生素D3 1.5×106 IU，维生素E
7.5×103 IU，维生素K 10 g/kg，维生素B1 12 g/kg，维生素B2 8 g/kg，盐酸吡哆醇12 g/kg，维生素B12 0.2 g/kg，烟酸35 g/kg，泛酸钙25 g/kg，叶酸2 g/kg，生物素0.1 g/kg，维生素C 100 g g/kg；复合矿物质含有：MgSO4 12 g/kg，FeSO4 2.5 g/kg，CuSO4 0.02 g/kg，MnSO4 0.15 g/kg，ZnSO4
0.353 g/kg，KIO3 0.003 g/kg，CoSO4 0.001 g/kg
①Dried Gracilaria lemaneiformis powder (dry matter) contained：Crude protein 18.4%，crude fat 0.5%，crude ash 19.1%.②Multi-vitamins contained：VA 3.6×106 IU，VD3 1.5×106 IU，VE 7.5×103 IU，VK 10 g/kg，VB1 12 g/kg，VB2 8 g/kg，pyridoxine hydrochloride 12 g/kg，VB12 0.2
g/kg，nicotinic acid 35 g/kg，calcium pantothenate 25 g/kg，folic acid 2
g/kg，biotin 0.1 g/kg，VC 100 g/kg；Minerals mixture contained：MgSO4 12 g/kg，FeSO4 2.5 g/kg，CuSO4 0.02 g/kg，MnSO4 0.15 g/kg，ZnSO4
0.353 g/kg，KIO3 0.003 g/kg，CoSO4 0.001 g/kg
1.4 样品收集
养殖试验结束后，试验鱼禁食24 h，用丁香酚(40 mg/L)麻醉后逐尾称重。

每缸随机挑取6尾，用不加抗凝剂的注射器于尾静脉采血，4 ℃、1 500 r/min离心15 min，取上层淡黄色液体即为血清，离心后的血清经液氮速冻后置于超低温冰箱保存备用。

将上述抽完血的试验鱼每个重复取3尾用于肝脏、肾脏和前肠取样，样
品装袋后经液氮速冻后于-80 ℃保存备测。

1.5 测定指标与方法
1.5.1 消化酶活性测定异育银鲫肝脏和前肠中胰蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(LPS)、
淀粉酶(amylase)活性测定均采用南京建成生物工程研究所试剂盒；粗酶液中蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝(南京建成生物工程研究所)染色法，具体测定方法参考试剂盒说明书。

1.5.2 前肠吸收相关酶活性测定前肠匀浆液蛋白含量和吸收相关酶：Na+ -K+ -ATP酶(Na+-K+-ATPase)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、肌酸激酶(CK)活性测定均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)进行测定，具体测定方法参考试剂盒说明书。

1.5.3 免疫及抗氧化相关酶活性测定异育银鲫肝脏和肾脏中溶菌酶(lysozyme)，
肝脏、肾脏和前肠酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、
过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性和总抗氧化能力(T-AOC)，肝脏丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体测定方法参考试剂盒说明书。

1.5.4 血清生化指标测定异育银鲫血清溶菌酶活性，丙二醛、总蛋白(TP)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)含量均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体测定方法参考试剂盒说明书。

1.6 数据分析
试验数据用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，用Duncan氏多重比较法检验差异显著性，结果均以平均值±标准误表示，以
P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果
2.1 龙须菜对异育银鲫消化吸收相关酶活性的影响
龙须菜对异育银鲫消化酶活性的影响见表2，对异育银鲫吸收相关酶活性的影响见表3。

由表2可知，龙须菜对异育银鲫肝脏的消化酶活性均无显著影响(P>0.05)；与对照组相比，D3、D4和D5组异育银鲫前肠胰蛋白酶活性降低(P>0.05)，D5组脂肪酶活性显著降低(P<0.05)。

由表3可知，与对照组相比，D1和D2组前肠γ-谷氨酰转肽酶活性显著升高(P<0.05)。

D1组异育银鲫前肠Na+-K+-ATP酶活性略高于对照组(P>0.05)，但显著高于D5组(P<0.05)。

2.2 龙须菜对异育银鲫免疫及抗氧化相关酶活性的影响
由表4可知，饲料中龙须菜替代水平≥6%时，异育银鲫血清溶菌酶活性显著高于对照组(P<0.05)。

当饲料中龙须菜替代水平≥9%时，异育银鲫的血清总蛋白含量呈现下降趋势，D5组则显著低于对照组(P<0.05)。

D5组异育银鲫血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性及D2、D3组总胆固醇含量均显著高于对照组(P<0.05)，而
D4、D5组血清甘油三酯含量显著低于对照组(P<0.05)。

由表5可知，与对照组相比，D1组异育银鲫肝脏超氧化物歧化酶活性显著升高(P<0.05)，而D5组则显著下降(P<0.05)；D1、D2和D3组异育银鲫肝脏过氧化氢酶活性有一定程度的上升(P>0.05)。

D1、D2及D3组异育银鲫肾脏酸性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)；D2、D3组异育银鲫前肠总抗氧化能力显著高于对照组(P<0.05)；D1组异育银鲫前肠碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，而D5组显著低于对照组(P<0.05)。

3 讨论
3.1 龙须菜对异育银鲫消化吸收相关酶活性的影响
肝脏是鱼类重要的代谢器官，鱼类主要通过肝胰脏分泌消化酶[9]，肠道中消化酶的活性变化受消化酶分泌与周转的影响。

董学兴等[10]研究表明，在饲料中添加螺旋藻能提高异育银鲫肝脏和肠道内的蛋白酶活性。

本试验中，各组试验鱼肝脏中胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性均无显著变化，表明龙须菜并未影响试验鱼肝胰脏消化酶的分泌，但D5组前肠脂肪酶活性显著低于对照组，推测龙须菜所含的以琼胶多糖为主的膳食纤维具有较高的黏性，能在一定程度上吸附饲料中的油脂，使脂肪酶的作用底物减少，导致酶活下降[11]。

鱼类肠道中Na+-K+-ATP酶、γ-谷氨酰转肽酶、肌酸激酶和碱性磷酸酶等在营养物质吸收过程中起重要作用，其活性在一定程度上可以反映鱼类对营养物质的吸收能力[12]。

本试验中，与对照组相比，D1、D2组试验鱼前肠Na+-K+-ATP酶活性有一定程度的提高，同时γ-谷氨酰转肽酶活性显著升高，表明饲料中添加少量
龙须菜有助于提高前肠对饲料营养物质的吸收能力[13]，徐树德[12]研究发现，摄食海藻饲料的蓝子鱼肠道γ-谷氨酰转肽酶活性高于对照组，与本研究结果一致。

李雅婷等[8]研究发现，在饲料中添加2%、3%龙须菜可显著提高眼斑拟石首鱼肠
道黏膜褶高度和杯状细胞数量，有助于肠道健康及对营养物质的吸收。

值得注意的是龙须菜生长过程中可能吸附了海水中较多的重金属离子，当试验鱼摄入的龙须菜过多时，过量的重金属离子可能抑制了前肠碱性磷酸酶的活性[14]。

3.2 龙须菜对异育银鲫免疫相关酶活性的影响
溶菌酶活性尤其是血清溶菌酶的活性是反映鱼类非特异性免疫能力的重要指标[15]。

本试验发现，当饲料中龙须菜添加量≥6%时，各组试验鱼血清溶菌酶活性均显著
升高，与徐树德[12]用含33%龙须菜的饲料饲喂蓝子鱼的研究结果相似。

董学兴
等[10]试验发现，饲料中添加0.2%～5.0%的螺旋藻能显著提高异育银鲫血清溶菌酶活性。

酸性磷酸酶是巨噬细胞溶酶体的标志酶，该酶被视为表征吞噬细胞活性大小的标志酶[16]。

本试验中，D1～D3组试验鱼肾脏酸性磷酸酶活性显著高于对照组，肝脏中该酶活性也有一定程度的提高，推测龙须菜藻粉可能通过增强巨噬细胞吞噬能力等途径促进了试验鱼免疫力的提升。

不少研究表明，膳食纤维吸水膨胀后具有黏性，可减缓胃肠道排空，影响胆固醇的吸收[17]。

本试验中，D2、D3组试验鱼血清胆固醇含量显著高于对照组，有研究表明，血清胆固醇含量的升高一定程度上意味着鱼体抗病能力的增强[18]，Wong 等[19]报道，一些海藻如Ecklonia cava，Colpomenia sinuosa和Sargassum hemiphyllum可促进小鼠肝脏内源性胆固醇的合成，提高其血清胆固醇水平；而
当饲料中龙须菜替代水平达15%时，试验鱼血清总蛋白含量显著下降，血清总蛋
白含量与动物的代谢水平和免疫能力相关，其含量下降在一定程度上反映试验鱼体质的下降[20-21]。

综合各项免疫相关指标，当龙须菜替代水平为6%左右时，可
一定程度增强异育银鲫的免疫性能，替代水平过高时则有损鱼体健康。

3.3 龙须菜对异育银鲫抗氧化相关酶活性的影响
超氧化物歧化酶对机体的氧化与抗氧化平衡起着重要作用，该酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤[22]。

本试验中，D1组试验鱼肝脏超氧化物歧化酶活性显著升高。

蔡春芳等[23]试验发现，在饲料中添加0.5%螺旋藻粉能提高银鲫血清超氧化物歧化酶活性。

李雅婷等[8]试验发现，在一定范围内(1%～4%)，随着龙须菜添加量的增加，眼斑拟石首鱼肝脏超氧化物歧化酶活性呈上升趋势，体外试验研究表明龙须菜中所含的含硫多糖有较高的抗氧化活性[24]，推测龙须菜中所含的多酚和海藻多糖类物质有利于异育银鲫超氧化物歧化酶活性的升高。

总抗氧化力反映了机体的总体抗氧化能力，包含了酶促系统(过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽及谷胱甘肽S-转移酶等)和非酶促系统(主要为维生素、氨基酸和金属蛋白酶等)清除氧自由基的总和[25]。

本试验中，D2、D3组试验鱼各组织抗氧化酶活性与对照组无显著差异，但前肠总抗氧化能力却显著升高，提示非酶促系统发挥了主要作用。

有研究表明龙须菜中的藻胆蛋白、类胡萝卜素等非酶促系统有抗氧化作用[6]，其膳食纤维基质结构会束缚小分子抗氧化物质，当龙须菜通过鱼体消化道时，经消化道生理环境和消化酶的联合作用，被束缚的小分子抗氧化物质会逐步释放出来，从而发挥抗氧化作用。

4 结论
本试验结果表明，饲料中龙须菜的添加量与免疫或抗氧化效果相关，少量添加龙须菜(3%～6%)可在一定程度上提高异育银鲫消化吸收与免疫性能，替代水平达15%时则会对鱼体健康产生负面影响。

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