SDS聚丙烯凝胶电泳实验方案

SDS聚丙烯凝胶电泳
一、试剂
（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。

（4）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（5）1%TEMED；
（6）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。

（7）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS
1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。

（8）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，
0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度
增加一倍配制）。

用来溶解标准蛋白质及待测固体。

（9）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。

（10）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。

二.实验步骤
1、组装模具
1）用海绵或纱布沾取少量清洁剂（也可用纯酒精浸泡），擦洗干净两块玻璃板，自来水冲洗3-5遍，然后，再用无水乙醇冲洗2遍，晾干待用。

2）将已冲洗好的玻璃板心均匀涂上凡士林，将玻璃板心放在玻璃板的两侧（下面一定要靠边），再将另一块玻璃板盖上待用。

3）将隔条安置好，再将事先准备好的琼脂溶液倒入电泳仪的槽中，再将两块玻璃板插入槽中，有缺口的放在里侧，用夹子夹好待用。

2、制胶
1）20ML10%分离胶/ML
分离胶贮液 6.66
分离胶缓冲液（PH8.9） 2.5
10%SDS 0.2
1%TEMET 2.00
重蒸水8.54
10%AP 0.1
（AP最后加入，注意观察是否漏胶）
2）水封，等待20-30分钟，用滤纸吸干
3）10ML 3%浓缩胶/ML
分离胶贮液 3.0
浓缩胶缓冲液（6.8） 1.25
10%SDS 0.1
1%TEMED 2.00
重蒸水 4.6
10%AP 0.1
4)插上齿梳，确保无气泡。

等待凝胶聚合，大概30分钟
5）聚合后，在上下槽内加入电极缓冲液，下面高度超过槽，（没必要太多）上面超过玻璃板低板，后缓慢拔出梳子，再用微量加样器非毛边一侧扶正。

吸缓冲液洗孔。

3、样品处理
1）将样品和标准蛋白溶液分别与样品溶解液以1：1混匀，沸水加热5min，离心10000r 5min。

2）用微量加样器将全部样品上样，小心不要让样品飘散或戳破凝胶。

4、电泳
连接号正负极导线，浓缩胶稳压100V，等跑到分离胶时通冷凝水，电压加至200V,至溴酚蓝到达分离胶底部。

5、染色和脱色
1）剥胶，将心剔出，用角匙插入玻璃之间（非耳的一侧）翻转，移去玻璃板，弃掉浓缩胶，在凝胶的右上角切去一块作标记。

2）染色：将凝胶小心放入染色液，40℃摇床摇4小时。

3）脱色：将凝胶浸泡入脱色液中，摇床摇上摇晃，之至底色透明，其间更换脱色液3-4次，观察蛋白电泳情况，拍照。