多肽类药物含量_效价_测定方法及其应用(精)
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福林－酚试剂法的缺点是易受多肽特异性的影响，即不同多肽类药物因酪氨酸和色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。Peterson法则对该法进行了改良，
进一步提高了检测的灵敏度。孙雪奇等［7］
采用Peterson法测定了视明注射液中微量多肽的含量，结果显示多肽含量在0. 98 15. 68μg内呈良好线性关系（r =0. 9997），表明该法适于微量蛋白质或多肽的含量测定。
［27］Shi C，Lu X，Ma C，et al．Enhancing the thermostability of
a novel β-agarase AgaB through directed evolution［J］．Appl Biochem Biotechnol，2008，151（1）：51-59.
［28］Craveiro K I，JúniorJ E G，Silva M C M，et al．Variant
Cry1Ia toxins generated by DNA shuffling are active against sugarcane giant borer［J］．J Biotechnol，2010，145（3）：215-221.
proteins using initiator tRNA［
J］．Methods，2005，36（3）：252-260.
［31］Thibodeaux G N，Liang X，Moncivais K，et al．Transfor-ming a pair of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA syn-thetase from Archaea to function in mammalian cells［J］．PLoS ONE，2010，5（6）：e11263.
［33］Ugwumba I N，Ozawa K，de la Cruz L，et al．Using a
genetically encoded fluorescent amino acid as a site-spe-cific probe to detect binding of low-molecular-weight com-pounds［J］．Assay Drug Dev Technol，2011，9（1）：50-57.［34］陈莉，金由辛，王德宝．tRNA介导蛋白质工程［J］
．生物工程进展，
2001，21（1）：11-14.［接受日期］2011-04-27［项目资助］中国药科大学大学生实践创新训练计划项目
（2010年）
*
通讯作者：胡育筑，教授；研究方向：
现代仪器分析；
Tel：025-83271280；
E-mail：njhuyuzu@126. com
多肽类药物含量（效价）测定方法及其应用
双缩脲法的原理是利用蛋白质和多肽分子中含有肽键（CO —NH —），具有双缩脲反应的特性，即
在碱性溶液中，蛋白质或多肽可与Cu 2+形成在540
nm波长处有最大吸收的紫色或蓝色络合物，其颜色的深浅与蛋白质或多肽浓度成正比，从而利用比色法特异性测定蛋白质和肽类物质的含量。在样品测定时，需预先用蛋白质标准溶液制作一个标准校正曲线，通常是将牛血清蛋白水溶液作为蛋白质标准溶液。该法虽精密度好，干扰物质少，但线性范围窄，准确性和灵敏度不高，一般测试质量浓度介于1 10g ·L－1之间，故常被用于对精确度要求不高的快速含量测定。王丹玺等［3］
采用总蛋白试剂盒（TP）双缩脲比色法，在540nm波长处测定兔脑垂体注射液中多肽的含量，并做回收率对照试验，结果测得平均回收率为97. 5%（RSD =1. 6%，n =6）。1. 3福林－酚试剂法
福林－酚试剂法是在双缩脲法的基础上发展起来的多肽含量测定方法，即在双缩脲反应体系中另加入福林－酚试剂（即磷钼酸－磷钨酸试剂），该试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色，显色量较双缩脲法增加，从而提高了检测的灵敏
确度高（RSD =0. 57%，
n =5）、重复性好（RSD =0. 61%，
n =5）。但因考马斯亮蓝G-250不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合，故并不能适用于所有肽类物质的定量测定。2
·综述与专论·
2011年第35卷第12期
第538
页
5382011，Vol．35，No．12
Progress in Pharmaceutical Sciences
1. 4
紫外分光光度法
紫外分光光度法适用于分子中含有芳香族氨基
酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸等）的多肽的定量分析，对不含芳香族氨基酸的肽的测定则灵敏度较低，原因在于前者在280nm处有最大吸收峰，且在此波长处的吸光值与蛋白浓度成正比。该法操作简便、迅速，样品可回收，但因所用有机溶剂（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类化合物及过氧化物等）易与多肽类药物产生相互作用，使药物共轭体系发生变化，从而影响其最大吸收峰，对测定造成干扰。尹翠娟等
［29］Rothschild K J，Gite S．tRNA-mediated protein engineer-ing［
J］．Curr Opin Biotechnol，1999，10（1）：64-70.［30］Olejnik J，Gite S，Mamaev S，et al．N-terminal labeling of
［32］Ye S，Ann Berger A，Petzold D，et al．Chemical aminoacy-lation of tRNAs with fluorinated amino acids for in vitro protein mutagenesis［J］．Beilstein J Org Chem，2010，6（40）：1-6.
become hydrolyzed make the accurate quantification of target molecules become very difficult，thusit is important to establish a sensitive，specificand accurate determination method. The content (or potency
考马亮蓝法
考马斯亮蓝法由Bradford于1976年首次提出，
其用于多肽含量测定具有以下优点：1）灵敏度高，定量限为1μg左右；2）测定快速、简便，只需加一
种试剂，
5min左右即可完成一个样品的测定；3）干扰物质少。该法可用于含碱性氨基酸的肽的含量测
定，如付英杰等［9］
采用该法测定阿胶低肽含量，准
［8］
采用紫外分光光度法对谷胱甘肽（GSH）片的含量进行测定，检测波长为230nm，经多次试验证实，
GSH在不同的溶剂和pH溶液中产生的最大吸收峰不同，当溶剂为0. 1mol ·L－1
NaOH溶液时，能消除某些干扰，得到稳定的结果，且回收率较
好，平均回收率为100. 5%（RSD =1. 18%，n =5）。1. 5
继进入临床。
与传统化学药物相比，多肽类药物结构特殊，且
相对分子质量较大［2］
，而且，还具有以下特点，导致在其含量的测定上存在困难：1）给药剂量小，
血药浓度低，
对检测方法的灵敏度和准确度要求较高；2）在酸、碱、高温条件下以及有机溶剂中易变性失
活，故在进行体内药物分析时对其样品的前处理条件苛刻。本文对目前多肽类药物的含量（效价）测定方法及其应用作一综述，为多肽类药物含量测定分析方法的建立和改进提供参考。1
度，
灵敏度为双缩脲法的100倍。福林－酚试剂法的蛋白质定量范围为25 250μg，测得结果准确、可靠，易操作，较凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝法更适用于寡肽的含量测定
［4-5］
。张海松等［6］
在研究一种国家一类新药—
——注射用心肌肽的含量测定方法时发现，双缩脲法和凯氏定氮法均存在灵敏度、
重复性不理想，而且测定所需时间过长不利于投料生产等问题；而福林－酚试剂法则具有快速、灵敏度高、测定供试品量较多等优点，在实际生产中特别是在配料后测定含量以确定分装体积时更具优势。
GAO Ying，
PAN Chun-yan，
ZHANG Wen-ting，
HU Yu-zhu
(Department of Analytical Chemistry，ChinaPharmaceutical University，Nanjing210009，China［Abstract］
The features of polypeptide drugs which are in small dose and low concentrations and easily
1. 1凯氏定氮法
凯氏定氮法是目前含氮化合物含量测定最常用的方法，其原理为：在硫酸铜的催化下，将样品用氧化性试剂消化分解而转化为硫酸铵，然后将硫酸铵溶液置蒸馏瓶中，在碱性条件下将其转化为氨，并随水蒸气馏出，用过量标准硼酸溶液吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，以甲基红为指示剂，根据标准酸消耗量计算出多肽的含量。该法所用仪器简单，测试结果准确，重复性好，但操作费时，试剂消耗量大，含氮的非肽类物质为主要干扰杂质。1. 2双缩脲法
［文献标志码］A
［文章编号］
1001－5094（2011）12－0536－07The Determination Method of Content /Potencyfor Polypeptide
Drugs and Their Application
DOU Xiao-rui，
AI Xiao-xia，
经典化学方法
多肽类药物含量测定方法与某些蛋白质含量测定方法类似，目前常用的4种经典含量测定方法有定氮法、
双缩脲法、福林－酚试剂法和紫外分光光度法，考马斯亮蓝法则是近10年才普遍使用的新的含量测定方法。这些方法虽灵敏度不高，干扰因素多，但有
一定的通用性和经济性，至今仍被用于蛋白质和多肽类药物的含量测定。
为此裴兵等33建立的抗c肽eu抗体夹心时间分辨免疫荧光分析trifma法能较好地解决这一问题其先在抗c肽包被反应孔中依次加入标准品及待测样本其中的包被的抗c肽c肽复合物以及随后加入的标志物抗c肽eu形成c肽eu被增强液解离到溶液中后可与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物其荧光强度与标准品及待测样本中的c肽浓度成正比故可通过荧光强度的测定获得c肽浓度
polypeptide drugs; content determination; potency determination
多肽类药物生物活性强，具有多种代谢和生理
调节功能，且易被消化吸收，在医药领域中有着广泛
的应用［1］
。近年来，多种具有免疫调节、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂功能的多肽类药物相
窦晓睿，艾小霞，高
荧，潘春燕，张文婷，胡育筑
*
（中国药科大学分析化学教研室，江苏南京210009）
［摘要］多肽类药物常因给药量小，浓度低且测定中易水解失活而难以准确定量，故建立灵敏、专一和准确的测定方法尤为重要。综述近年来多肽类药物含量（效价）的测定方法，包括经典化学方法、高效液相色谱法、电泳法、生物检定法及免疫标记法等在肽类物质研究中的最新应用进展。［关键词］多肽类药物；含量测定；效价测定［中图分类号］TQ 460. 72
·综述与专论·
2011年第35卷
第12期
第536
页
5362011，Vol．35，No．12
Progress in Pharmaceutical Sciences
［26］Nomura Tetsuya，Abe Yasuhiro，Kamada Haruhiko，et al．
Novel protein engineering strategy for creating highly re-ceptor-selective mutant TNFs［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，388（4）：667-671.
2011，Vol．35，No．12537
Progress in Pharmaceutical
Sciences
·综述与专论·
2011年第35卷
第12期
第537页
determination methods for polypeptide drugs in recent years，includingclassical chemical method，high-performance liquid chromatography，capillaryelectrophoresis，bioassayand immunoassay were reviewed.［Keywords］
进一步提高了检测的灵敏度。孙雪奇等［7］
采用Peterson法测定了视明注射液中微量多肽的含量，结果显示多肽含量在0. 98 15. 68μg内呈良好线性关系（r =0. 9997），表明该法适于微量蛋白质或多肽的含量测定。
［27］Shi C，Lu X，Ma C，et al．Enhancing the thermostability of
a novel β-agarase AgaB through directed evolution［J］．Appl Biochem Biotechnol，2008，151（1）：51-59.
［28］Craveiro K I，JúniorJ E G，Silva M C M，et al．Variant
Cry1Ia toxins generated by DNA shuffling are active against sugarcane giant borer［J］．J Biotechnol，2010，145（3）：215-221.
proteins using initiator tRNA［
J］．Methods，2005，36（3）：252-260.
［31］Thibodeaux G N，Liang X，Moncivais K，et al．Transfor-ming a pair of orthogonal tRNA-aminoacyl-tRNA syn-thetase from Archaea to function in mammalian cells［J］．PLoS ONE，2010，5（6）：e11263.
［33］Ugwumba I N，Ozawa K，de la Cruz L，et al．Using a
genetically encoded fluorescent amino acid as a site-spe-cific probe to detect binding of low-molecular-weight com-pounds［J］．Assay Drug Dev Technol，2011，9（1）：50-57.［34］陈莉，金由辛，王德宝．tRNA介导蛋白质工程［J］
．生物工程进展，
2001，21（1）：11-14.［接受日期］2011-04-27［项目资助］中国药科大学大学生实践创新训练计划项目
（2010年）
*
通讯作者：胡育筑，教授；研究方向：
现代仪器分析；
Tel：025-83271280；
E-mail：njhuyuzu@126. com
多肽类药物含量（效价）测定方法及其应用
双缩脲法的原理是利用蛋白质和多肽分子中含有肽键（CO —NH —），具有双缩脲反应的特性，即
在碱性溶液中，蛋白质或多肽可与Cu 2+形成在540
nm波长处有最大吸收的紫色或蓝色络合物，其颜色的深浅与蛋白质或多肽浓度成正比，从而利用比色法特异性测定蛋白质和肽类物质的含量。在样品测定时，需预先用蛋白质标准溶液制作一个标准校正曲线，通常是将牛血清蛋白水溶液作为蛋白质标准溶液。该法虽精密度好，干扰物质少，但线性范围窄，准确性和灵敏度不高，一般测试质量浓度介于1 10g ·L－1之间，故常被用于对精确度要求不高的快速含量测定。王丹玺等［3］
采用总蛋白试剂盒（TP）双缩脲比色法，在540nm波长处测定兔脑垂体注射液中多肽的含量，并做回收率对照试验，结果测得平均回收率为97. 5%（RSD =1. 6%，n =6）。1. 3福林－酚试剂法
福林－酚试剂法是在双缩脲法的基础上发展起来的多肽含量测定方法，即在双缩脲反应体系中另加入福林－酚试剂（即磷钼酸－磷钨酸试剂），该试剂在碱性条件下，易被多肽中酪氨酸的酚基还原呈蓝色，显色量较双缩脲法增加，从而提高了检测的灵敏
确度高（RSD =0. 57%，
n =5）、重复性好（RSD =0. 61%，
n =5）。但因考马斯亮蓝G-250不与单体精氨酸、赖氨酸以及相对分子质量小于3000的多肽结合，故并不能适用于所有肽类物质的定量测定。2
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2011年第35卷第12期
第538
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5382011，Vol．35，No．12
Progress in Pharmaceutical Sciences
1. 4
紫外分光光度法
紫外分光光度法适用于分子中含有芳香族氨基
酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸等）的多肽的定量分析，对不含芳香族氨基酸的肽的测定则灵敏度较低，原因在于前者在280nm处有最大吸收峰，且在此波长处的吸光值与蛋白浓度成正比。该法操作简便、迅速，样品可回收，但因所用有机溶剂（如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类化合物及过氧化物等）易与多肽类药物产生相互作用，使药物共轭体系发生变化，从而影响其最大吸收峰，对测定造成干扰。尹翠娟等
［29］Rothschild K J，Gite S．tRNA-mediated protein engineer-ing［
J］．Curr Opin Biotechnol，1999，10（1）：64-70.［30］Olejnik J，Gite S，Mamaev S，et al．N-terminal labeling of
［32］Ye S，Ann Berger A，Petzold D，et al．Chemical aminoacy-lation of tRNAs with fluorinated amino acids for in vitro protein mutagenesis［J］．Beilstein J Org Chem，2010，6（40）：1-6.
become hydrolyzed make the accurate quantification of target molecules become very difficult，thusit is important to establish a sensitive，specificand accurate determination method. The content (or potency
考马亮蓝法
考马斯亮蓝法由Bradford于1976年首次提出，
其用于多肽含量测定具有以下优点：1）灵敏度高，定量限为1μg左右；2）测定快速、简便，只需加一
种试剂，
5min左右即可完成一个样品的测定；3）干扰物质少。该法可用于含碱性氨基酸的肽的含量测
定，如付英杰等［9］
采用该法测定阿胶低肽含量，准
［8］
采用紫外分光光度法对谷胱甘肽（GSH）片的含量进行测定，检测波长为230nm，经多次试验证实，
GSH在不同的溶剂和pH溶液中产生的最大吸收峰不同，当溶剂为0. 1mol ·L－1
NaOH溶液时，能消除某些干扰，得到稳定的结果，且回收率较
好，平均回收率为100. 5%（RSD =1. 18%，n =5）。1. 5
继进入临床。
与传统化学药物相比，多肽类药物结构特殊，且
相对分子质量较大［2］
，而且，还具有以下特点，导致在其含量的测定上存在困难：1）给药剂量小，
血药浓度低，
对检测方法的灵敏度和准确度要求较高；2）在酸、碱、高温条件下以及有机溶剂中易变性失
活，故在进行体内药物分析时对其样品的前处理条件苛刻。本文对目前多肽类药物的含量（效价）测定方法及其应用作一综述，为多肽类药物含量测定分析方法的建立和改进提供参考。1
度，
灵敏度为双缩脲法的100倍。福林－酚试剂法的蛋白质定量范围为25 250μg，测得结果准确、可靠，易操作，较凯氏定氮法、双缩脲法和考马斯亮蓝法更适用于寡肽的含量测定
［4-5］
。张海松等［6］
在研究一种国家一类新药—
——注射用心肌肽的含量测定方法时发现，双缩脲法和凯氏定氮法均存在灵敏度、
重复性不理想，而且测定所需时间过长不利于投料生产等问题；而福林－酚试剂法则具有快速、灵敏度高、测定供试品量较多等优点，在实际生产中特别是在配料后测定含量以确定分装体积时更具优势。
GAO Ying，
PAN Chun-yan，
ZHANG Wen-ting，
HU Yu-zhu
(Department of Analytical Chemistry，ChinaPharmaceutical University，Nanjing210009，China［Abstract］
The features of polypeptide drugs which are in small dose and low concentrations and easily
1. 1凯氏定氮法
凯氏定氮法是目前含氮化合物含量测定最常用的方法，其原理为：在硫酸铜的催化下，将样品用氧化性试剂消化分解而转化为硫酸铵，然后将硫酸铵溶液置蒸馏瓶中，在碱性条件下将其转化为氨，并随水蒸气馏出，用过量标准硼酸溶液吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，以甲基红为指示剂，根据标准酸消耗量计算出多肽的含量。该法所用仪器简单，测试结果准确，重复性好，但操作费时，试剂消耗量大，含氮的非肽类物质为主要干扰杂质。1. 2双缩脲法
［文献标志码］A
［文章编号］
1001－5094（2011）12－0536－07The Determination Method of Content /Potencyfor Polypeptide
Drugs and Their Application
DOU Xiao-rui，
AI Xiao-xia，
经典化学方法
多肽类药物含量测定方法与某些蛋白质含量测定方法类似，目前常用的4种经典含量测定方法有定氮法、
双缩脲法、福林－酚试剂法和紫外分光光度法，考马斯亮蓝法则是近10年才普遍使用的新的含量测定方法。这些方法虽灵敏度不高，干扰因素多，但有
一定的通用性和经济性，至今仍被用于蛋白质和多肽类药物的含量测定。
为此裴兵等33建立的抗c肽eu抗体夹心时间分辨免疫荧光分析trifma法能较好地解决这一问题其先在抗c肽包被反应孔中依次加入标准品及待测样本其中的包被的抗c肽c肽复合物以及随后加入的标志物抗c肽eu形成c肽eu被增强液解离到溶液中后可与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物其荧光强度与标准品及待测样本中的c肽浓度成正比故可通过荧光强度的测定获得c肽浓度
polypeptide drugs; content determination; potency determination
多肽类药物生物活性强，具有多种代谢和生理
调节功能，且易被消化吸收，在医药领域中有着广泛
的应用［1］
。近年来，多种具有免疫调节、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂功能的多肽类药物相
窦晓睿，艾小霞，高
荧，潘春燕，张文婷，胡育筑
*
（中国药科大学分析化学教研室，江苏南京210009）
［摘要］多肽类药物常因给药量小，浓度低且测定中易水解失活而难以准确定量，故建立灵敏、专一和准确的测定方法尤为重要。综述近年来多肽类药物含量（效价）的测定方法，包括经典化学方法、高效液相色谱法、电泳法、生物检定法及免疫标记法等在肽类物质研究中的最新应用进展。［关键词］多肽类药物；含量测定；效价测定［中图分类号］TQ 460. 72
·综述与专论·
2011年第35卷
第12期
第536
页
5362011，Vol．35，No．12
Progress in Pharmaceutical Sciences
［26］Nomura Tetsuya，Abe Yasuhiro，Kamada Haruhiko，et al．
Novel protein engineering strategy for creating highly re-ceptor-selective mutant TNFs［J］．Biochem Biophys Res Commun，2009，388（4）：667-671.
2011，Vol．35，No．12537
Progress in Pharmaceutical
Sciences
·综述与专论·
2011年第35卷
第12期
第537页
determination methods for polypeptide drugs in recent years，includingclassical chemical method，high-performance liquid chromatography，capillaryelectrophoresis，bioassayand immunoassay were reviewed.［Keywords］