基因工程

有特异性 对DNA片段 片段 无选择性 具备条件 种类 人工改造
DNA连接酶 DNA连接酶
来自大肠杆菌 T4噬菌体 T4噬菌体
磷 酸 二 酯 键 P4
（运）载体 P6
EcoRI
EcoRI
双链 中的GAATTC 中的 识别的序列是 双链DNA中的 GA之间的磷酸二酯键 之间的磷酸二酯键 切点是
某种限制酶将DNA分子切成下图 例 某种限制酶将 分子切成下图 所示的粘性末端
DNA如何复制？ 如何复制？ 如何复制
DNA聚合酶 聚合酶 DNA聚合酶 聚合酶
DNA连接酶 连接酶
引物Biblioteka DNA连接酶 连接酶连接成DNA的酶 的酶 连接成 水解DNA的酶 的酶 水解 切割DNA的酶 的酶 切割 连接RNA的酶 的酶 连接 水解RNA的酶 的酶 水解 基因工程中的酶
DNA聚合酶 聚合酶 DNA酶 酶 限制酶 RNA聚合酶 聚合酶 RNA酶 酶 DNA连接酶 连接酶
4、目的基因的表达和检测
大量的受体细胞接受不多的目的基因。 大量的受体细胞接受不多的目的基因。处 理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少， 理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少， 必须将它从中检测出来。 必须将它从中检测出来。 将每个受体细胞单独培养形成菌落， 将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测 菌落中是否有目的基因的表达产物。 菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表 达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、 达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、 研究。 研究。
P10
DNA变性 DNA变性 双链解聚为单链
低温55-60 低温 复性 引物与模板结合 引物与模板结合
中温70-75 中温 延伸 Taq酶 引物起始合成 Taq酶从引物起始合成 互补链
3’
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 引物I 引物 引物II 引物
5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’
DNA连接酶 连接酶
TaqDNA聚合酶 聚合酶
限制酶
TaqDNA聚合酶 聚合酶
将DNA分子切成片段 分子切成片段 将DNA片段连接起来 片段连接起来 将DNA双链解开 双链解开
限制酶 DNA连接酶 连接酶 解旋酶
在DNA上 上
启动子 终止子 遗传信息
在mRNA上 上
起始密码 终止密码 遗传密码
练习： 练习：
(1)目的基因是否插入到转基因生物的 目的基因是否插入到转基因生物的DNA上？ 目的基因是否插入到转基因生物的 上
分 子 水 平 个体 水平
DNA分子杂交技术 提取 分子杂交技术 提取DNA与探针杂交 与探针杂交 (2)目的基因是否转录出了 目的基因是否转录出了mRNA? 目的基因是否转录出了 分子杂交技术 提取mRNA与探针杂交 提取 与探针杂交 (3)目的基因是否翻译出了蛋白质？ 目的基因是否翻译出了蛋白质？ 目的基因是否翻译出了蛋白质 提取蛋白质与抗体杂交 抗原-抗体杂交 抗原 抗体杂交 (4)该转基因生物是否获得了定向改造的性状？ 该转基因生物是否获得了定向改造的性状？ 该转基因生物是否获得了定向改造的性状
基因工程及其应用
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术 重组技术 基因工程又叫做基因拼接技术或 通俗的说，就是按照人们的意愿， 。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种 生物的某种基因提取出来，加以修饰改造， 生物的某种基因提取出来，加以修饰改造， 然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造 然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造 生物的性状。 生物的性状。 供体细胞 目的基因 受体细胞
操作水平： 操作水平： DNA分子水平 分子水平 原理： 原理： 基因重组 基因重组 操作环境： 操作环境：生物体外 定向改造生物的性状 获得人类所需要的品种。 改造生物的性状， 结 果： 定向改造生物的性状，获得人类所需要的品种。
二、 基因操作的工具
限制性内切酶 限制酶） （限制酶）
来自原核生物
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
1、目的基因的获取(1)从基因中获取目的基因 (1)从基因中获取目的基因
现有人的肝脏细胞和胰岛细胞， 现有人的肝脏细胞和胰岛细胞，如何得到胰岛素基因
(2)利用PCR技术扩增目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 利用PCR技术
原理：利用DNA双链复制的原理 原理：利用DNA双链复制的原理 DNA 高温90-95 高温 解链
Ａ ⒈要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是（ ） 要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是（
①限制酶 Ａ．①② Ａ．①②
②连接酶 Ｂ．③④ Ｂ．③④
③解旋酶 Ｃ．①④ Ｃ．①④
④还原酶 Ｄ．②③ Ｄ．②③
⒉实施基因工程的第一步的一种方法是把所需的基因从 供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。 供体细胞内分离出来，这要利用限制性内切酶。一种限 制性内切酶能识别ＤＮＡ分子的ＧＡＡＴＴＣ顺序， ＤＮＡ分子的ＧＡＡＴＴＣ顺序 制性内切酶能识别ＤＮＡ分子的ＧＡＡＴＴＣ顺序，切 点在Ｇ 之间，这是利用了酶的（ 点在Ｇ和Ａ之间，这是利用了酶的（Ｂ ） Ａ．高效性 Ａ．高效性 Ｃ．多样性 Ｃ．多样性 Ｂ．专一性 Ｂ．专一性 Ｄ．催化活性易受外界影响 Ｄ．催化活性易受外界影响
则该种限制酶识别的特定核苷酸序列是
…TCTAGA… …AGATCT…
DNA连接酶 DNA连接酶
连接酶的作用是： 连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性 末端(磷酸二酯键)连接起来， 末端(磷酸二酯键)连接起来，使之成为一个完 整的DNA分子。 整的DNA分子。 DNA分子
DNA连接酶 E.coli DNA连接酶 DNA连接酶 T4 DNA连接酶
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’
引物必需满足的要求 引物应具有特异性 引物一般在 15~30 碱基之间 含量在40%~60%之间 引物 G C含量在 含量在 之间 有利于启动Taq 有利于启动 酶进行 反应
引物自身内部不应存在互补序列， 引物自身内部不应存在互补序列，否则因自身折 叠失效 两引物之间不应存在互补序列 ，否则失 效
三、工程基本步骤
1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 （核心） 核心） 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定 检查是否成功
核心） 2、基因表达载体的构建 （核心） 动动手： 画一个构建好的基因表达载体， 动动手： 画一个构建好的基因表达载体， 并注明各部分名称
4、目的基因的检测与鉴定 检查是否成功