圆二色谱和紫外可见光谱研究抗体_卟啉的相互作用

圆二色谱和紫外可见光谱研究抗体-卟啉的相互作用
祁 超
1,2 李伟国1 张玉静2 刘立岩2 赵大庆*11
(中国科学院长春应用化学研究所稀土化学与物理开放实验室,长春130022)2(中国人民解放军军需大学生物化学教研室,长春130062)
摘 要 圆二色谱(CD)和紫外可见光谱(UV -VIS)可用来研究单克隆抗体(McAb)-卟啉之间的相互作用。

卟
啉形成McAb -卟啉复合物,在Soret 带区域最大吸收峰有显著红移和增色现象。

在350~450nm 区域,形成复
合物时能检测诱导的CD 光谱。

CD 光谱遵守朗伯-比尔定律,显示等吸收行为。

McAb -卟啉复合物的紫外可见
吸收及诱导的CD 光谱在p H 6~11的范围内保持不变,说明复合物异常稳定,也说明M cAb -卟啉结合位点之
间疏水相互作用是主要因素。

关键词 圆二色谱,紫外可见光谱,单克隆抗体,meso -四(A ,A ,A ,A -O -苯乙酰苯)卟啉
2001-06-24收稿;2001-11-09接受
本文系国家自然科学基金(29701005)和中国科学院基础局重大项目(KJ951-A1-504-02)资助课题
1 引 言
圆二色谱(C D)对溶液中蛋白质的立体结构变化高度灵敏,并且能检测立体化学的微小变化[1]。

对称半抗原的发色团同专一抗体的非共价结合能产生诱导的C D 带。

在抗体结合位点的非对称环境中,非光学活性的半抗原与抗体结合能产生这种诱导光学活性。

因此,在半抗原的发色团吸收区域会产生附带的科顿效应。

附带的科顿效应能明显区别相似专一性之间的抗体结合位点,能用来检测互补决定区(CDR)[2~6]。

我们根据文献[7]
合成的meso -四(A ,A ,A ,A -O -苯乙酰苯)卟啉,不加载体进行免疫,得到的抗体[8]来模拟加卤过氧化物酶[9]。

该单克隆抗体对卟啉有高亲合力,为了较好地了解McAb -卟啉之间的相互作用,
获得Mc Ab -卟啉之间的结构信息是很重要的。

因此,我们用诱导的CD 连同紫外可见光谱来研究McAb -卟啉形成的复合物。

2 实验部分
紫外可见光谱用UV -Vis 922光谱仪(Kontrin 公司)测定,用1cm 池。

圆二色谱用JASCO J )500C 旋光分光仪来测定,用1c m 池。

用磷酸缓冲溶液(PB S,pH 7.00)来配制meso -四(A ,A ,A ,A -O -苯乙酰苯)卟啉储备液(1.0@10-6mol P L),所有光谱测定都在20e 下进行。

抗体类型为I gG2a(电泳纯)[8]。

把适当数量的Mc Ab 储备液加到800L L 卟啉储液中混匀,进行Mc Ab -卟啉复合物实验。

每个实验持续大约10min,其中包括混合和测定的时间。

所有卟啉测试都加一个非相关Mc Ab(2,4-二硝基氟苯诱导的)。

所有UV 和CD 光谱都做双份。

3 结果和讨论
311 UV -VIS 研究
结果如图1所示。

如图中所示,形成抗体-卟啉复合物,伴随有UV 光谱变化。

在Soret 带区域变化最显著,最大吸收发生红移和增色效应,曲线b 比曲线a 红移8nm,从曲线a 408nm 红移到曲线b 416nm 。

红移和增色效应可能反映了苯乙酰苯基与抗体刚性且紧密的结合,因此扩展了发色团。

312 诱导的CD
结果如图2所示。

光谱遵守朗伯-比尔定律,显示等吸收行为。

这表明光谱变化不是从聚集现象产生的[10]。

使用大过量的非相关McAb(2,4-二硝基氟苯诱导的)作对照实验,在这区域并未显示出可测的第30卷
2002年5月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究简报
Chinese Journal of Analytical Chemistry 第5期
601~604
CD光谱。

从这些数据得到的唯一结论就是看到的诱导CD信号反应了专一性结合现象。

游离卟啉或McAb在Soret区域都没显示出可测的CD光谱。

313CD光谱差异
结果见图3和图4。

只有Mc Ab1F2与抗原meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)
卟啉形成的复合物信号强
图1meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉与McAb1F2结合伴随的UV-VIS变化
Fi g.1Ultraviole-t visible(UV-VIS)changes accompanying binding of meso-tetra(A,A,A,A-O-phenylacetyl benzene) porphyrin(p H7.00phosphate buffer solution,20e)
a.meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉(meso-tetra(A,A,A,A-O-phenylacetyl benzene)porphyrin)(1.0@10-6mol P L);
b.在M c Ab1F2 (2.50@10-6mol P L)存在下,在同一条件下的meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉(monoclonal antibody(M c Ab)( 2.50@10-6 mol P L)-meso-tetra(A,A,A,A-O-phenylace tyl benzene)porphyrin(1.0 @10-6mol P L))。

图2meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉与McAb1F2的诱导的CD光谱
Fig.2Induced circular diochoism(CD)spectra of meso-tetra(A,A,A,A-O-phenylacetyl benzene)porphyrin and McAb 1F2
McAb1F2B卟啉(porphyrin):a10;b10.5;c12;d13;e14;f15。

度最大,说明它们结合的最紧密,能很好地互相识别。

这与抗原-抗体能专一性互相识别是一致的。

UV和CD效应都是由蛋白质残基干扰卟啉发色团产生的,应能看到诱导CD强度和UV吸收变化强度(K max和E)之间的相关性。

从图3和图4可以看出,meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉展示了最强的CD 信号,也显示了紫外可见光谱上的巨大变化(见图1)。

3.4pH依赖性
在pH6~12之间,UV吸收保持稳定。

在pH5以下,吸收减到pH6~12之间的三分之一,并且信号显著变宽。

在pH6~11范围内,CD信号在强度和形状方面保持不变。

这种显著的稳定性很可能反应了半抗原的苯乙酰苯基与抗体结合位点之间的强烈疏水相互作用。

很明显,在卟啉和C DR(互补决定区)残基(对诱导CD效应起作用)之间(抗体结合位点及距离方面),卟啉的有关定向并未改变。

4结论
诱导的CD是一种很有用的工具,可以用来研究卟啉与互补McAb之间的相互作用。

在卟啉Soret 带区域,当McAb-卟啉复合物形成时,最大吸收会有显著红移和增色效应。

同一区域(350~450nm)的诱导CD光谱遵守朗伯-比尔定律,显示等吸收行为。

Mc Ab1F2-meso-四(A,A,A,A-O-苯乙酰苯)卟啉复合物的UV-VIS吸收和诱导CD光谱在pH6~11之间保持不变,表明McAb-卟啉复合物非常稳定,反应了半抗原的苯乙酰苯基与抗体结合位点之间的强烈疏水相互作用是稳定的主要因素。

602分析化学第30卷
图3 M cAb1F2与5个不同卟啉的CD 光谱
Fig.3 Induced CD spectra of McAb 1F2wi th five different
porphyrin and phthaloyanine
a.四(A ,A ,A ,A -O -三甲铵苯)卟啉(te tra(A ,A ,A ,A -O -trimethylamine
benzene)porphyrin);b.酞菁绿(phthaloyanine green);c.meso -四
(A ,A ,A ,A -O -苯乙酰苯)卟啉(meso -tetra(A ,A ,A ,A -O -phenylacetyl
benzene )porphyri n ); d.锰卟啉(Mn -me so -tetra (A ,A ,A ,A -O -
phenylacetyl benzene)porphyri n );e.酞菁蓝(phthaloyanine blue)。

其余条件同上(other conditi ons are same as in Fi g.1and Fi g.2)。

图4 meso -四(A ,A ,A ,A -O -苯乙酰苯)卟啉与四种不同McAb 的诱导CD 光谱(实验细节见图2)Fig.4Induced CD spectra of meso -tetra (A ,A ,A ,A -O -phenylacetyl benzene)porphyrin with four different McAbs 3G6、4F3、3B4由2,4-二硝基-1-氟苯所诱导(3G6、4F3、3B4were induced by 2,4-dini tro -1-fluorobenzene)。

致 谢 感谢中国科学院生物物理研究所国家生物大分子重点实验室王大成研究员和周均梅研究员给予的无私帮助。

References
1 Cantor C R,Schimel P R.Biophysics and Biochemistry (Part Ò).1980:418~424
2 Con way -Jacobs A,Cchechter B,Sela M.Biochem .,1970,9:4870~4876
3 Glaser M ,Singer S J.Pr oc .Natl .Acad .Sci .,USA.1971,68:2477~2479
4 Rockey J H,Dorrington K J,Mon tgomery P C.Nature ,1971,232:192~194
5 Rockey J H,Dorrington K J,Mon tgomery P C.J .Immunol .Meth .,1971,1:67~70
6 Rockey J H,Montgomery P C,Underdown B J.Biochem .,1972,11:3172~3181
7 James P C,Robert R G,Christopher A R.J .Am .Chem .Soc .,1975,97(6):1427~1439
8 Qi Chao,Liu Liyan,Zhang Yujin,Du Li.Chinese J .Cell Mol .Immunol .,2000,16(6):511~512
9 Qi Chao(祁 超),Ding Lan(丁 兰),Liu Zi(刘 仔),Zhang Yujing(张玉静),Zhao Daqing(赵大庆).J .Appl .Chem .,2001,18(7):560~562
10 Pasterback R F,Brigandi R A,Abrams M J.J .I norg .Che m .,1990,29:4483~4486
603第5期祁 超等:圆二色谱和紫外可见光谱研究抗体-卟啉的相互作用
604分析化学第30卷
Studied on the Interactions of Antibody-Porphyrin by Circular
Dichroism and Ultraviolet-Visible Spectrophotometry
Qi Chao1,2,Li Wei guo1,Zhang Yujing2,Liu Liyan2,Zhao Daqing*1
1(Key Labor a tory o f Rare Chemistry and Ph ysica l,Changchun I nstitute o f Applied Chemistry,
Chinese A cademy o f Sciences,Changchun130022)
2(De p a rtment of Biochemistry,Quartermaste r University of People c s Liberation Arm y,Changchun130062)
Abstract Circular dichoism and UV-vis measurements were used to study the interaction between porphyrin and monoclonal antibodies(Mc Abs).Mc Abs-porphyrin complex formation is usually accompanied by significant bathochromic shift and hyperchromicity changes of the absorption maxima in the porphyrin soret band region. Induced CD spectra in the same region(350~450nm)were detected upon complex formation.They follo w Lamb-Beer c s law and exhibit isosbestic behavior.Both the UV-Vis and induced CD spectra of the antibody:porphyrin comple x remain unchanged over a broad pH range(pH6~11),indicating remarkable stability of the complex and reflecting the dominant role of hydrophobic interaction between the hapten benzophenone and the antibody combining site.
Keywords Circular diochroism,ultraviole-t visible spectrum,monoclonal antibodies,meso-tetra(A,A,A,A-O-phenylacetyl benzene)porphyrin
(Received24June2001;accepted9November2001)
欢迎订阅5分析化学6(2002年)
邮发代号12-6
本刊承办广告业务
5分析化学6(ISSN0253-3820,C ODEN FHHHDT,CN22-1125/O6)是中国科学院和中国化学会共同主办的专业性学术期刊,主要报道我国分析化学创新性研究成果,反映国内外分析化学学科前沿和进展。

刊物设有研究报告、研究简报、评述与进展、仪器装置与实验技术、来稿摘登等栏目。

读者对象为从事分析化学研究和测试的科技人员及大专院校师生。

本刊也是有关图书、情报等部门必不可少的信息来源。

5分析化学6目前是我国自然科学核心期刊及全国优秀科技期刊,荣获1999年首届国家期刊奖和2000年中国科学院优秀期刊特别奖,2001年入选/中国期刊方阵0高知名度、高学术水平的/双高0期刊。

论文已被包括美、英、日、俄的国内外近20种刊物和检索系统收录。

根据中国科技信息研究所历年来发布的/中国科技期刊引证报告0获悉,本刊总被引频次和影响因子均居中国科技期刊排序前列,1999年和2000年其被引频次和影响因子均居化学类期刊第一名。

多年来,本刊逐年被选入美国权威文摘5化学文摘6(CA)摘引量最大的1000种期刊(简称/C A千种表0)中,并居我国入选/CA千种表0期刊的前列。

从1999年第27卷第一期开始被美国科学信息研究所(Institute for Scientific Informati on)正式收入5科学引文索引扩大版6(Science Citation Index-Expanded,SCIE,also known as SciSearch),同时还被收入5Research Alert6和5Chemistry Citation Index6等ISI系列。

本刊是我国发行量、报道容量和国内外影响较大的科技学术期刊之一。

本刊为月刊,每期128页(大16开),由科学出版社出版。

国内单价9100元,全年(含邮费)108100元。

邮发代号12-6,全国各地邮局订阅,国外代号M336,中国国际书店订购,漏订读者,可与编辑部联系。

广告经营许可证:吉工商广字0085号。

编辑部地址:长春市人民大街159号邮政编码:130022电话:(0431)5262017P5262018
传真:(0431)5262018E-mail:fxhx@ P fxh x@。