我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定

中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine
第42卷第10期
2020年10月
Vbl.42No.10Oct. 2020
doi ：10.3969/j.issn.l008-0589.202001025
我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定
张敏敏I,孙亚杰2,刘文兴I,刘任强I,王喜军I,步志高”
(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150069;
2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特010018)
摘要：牛结节性皮肤病(LSD)是由羊痘病毒属牛结节性皮肤病病毒(LSDV )引起的牛的烈性传染病。

2019年8
月，我国首次在新疆伊犁地区发现疑似LSD 疫情。

本研究采集伊犁疫情临床症状典型病牛病变皮肤组织，接种羊睾 丸(LT)细胞，对出现典型细胞病变的培养物进行了系列鉴定。

透射电镜观察到典型痘病毒形态的砖型粒子；山羊痘 高免血清间接免疫荧光检测培养病变细胞显示阳性反应；LSDV 基因组特异引物PCR 检测结果为阳性；二代测序
(De novo)全基因组分析显示与LSDV/Russia/Saratov/2017(MH646674.1)同源性最高(99.42%);系统进化分析显示与
LSDV/Russia/Saratov/2017株相似，介于疫苗株和野毒株分支之间；病毒生长曲线测定显示感染LT 细胞的生长特性与 已报道的山羊痘病毒相似。

上述结果表明，本实验分离得到引起我国首次LSD 疫情的病毒株，命名为LSDV/China/
Xinjiang/2019株(Xinjiang/2019),本研究为牛结节性皮肤病的防治奠定了基础。

关键词：牛结节性皮肤病病毒；分离鉴定；进化分析
中图分类号：S857.5 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2020)10-1058-04
Isolation and identification of lumpy skin disease virus from the
first outbreak in China
ZHANG Min-min 1, SUN Ya-jie 2, LIU Wen-xing 1, LIU Ren-qiang 1, WANG Xi-jun 1, BU Zhi-gao 1*
*收稿日期：2020-01-16
基金项目："十三五”国家重点研发计划项目(2018YFC1200601);国家青年基金项目(31602074) 作者简介：张敏敏(1984-),女，内蒙古赤峰人，副研究员，主要从事羊痘病毒研究.* 通信作者：E-mail : ****************
(1. State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Harbin 150069, China; 2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University Hohhot 01001 & China)
Abstract: Lumpy skin disease (LSD) is a highly contagious cattle disease caused by lumpy skin disease virus (LSDV),
belonging to the genus Capripoxvirus. In August 2019, an outbreak of suspected LSD occurred in the Yili area of Xinjiang
autonomous region. In this study, skin samples were collected from the cattle with LSD typical signs for virus isolation. Cytopathic
effects (CPE) were observed after inoculation of lamb testis (LT) cells. Subsequently, the isolated virus was identified by different
methods and the following results were obtained: Brick- shaped viral particles can be visualized by electron microscopy using negative staining. Both indirect immunofluorescence assay and PCR detection were positive for LSDV In addition, next-generation
sequencing (De Novo) analysis revealed that the isolate, designated as LSDV/China/Xinjiang/2019 (Xinjiang/2019), shared the
highest homology with LSDV/Russia/Saratov/2017(MH646674.1) (99.42%). Phylogenetic analysis showed that the LSDV/China/
Xinjiang/2019 clusters between the LSDV vaccine strain and the field strain LSDV Russia/Saratov/2017. Besides, the growth
kinetics of the LSDV in LT cells was similar to that of GTPV Taken together, we isolated the LSDV Xinjiang/2019 strain that was
♦Corresponding author
第10期张敏敏，等•我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定1059
responsible in China,which is a basic work for the prevention and control of LSD.
Key words：Lumpy skin disease virus;isolation and identification;phylogenetic analysis
牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease,LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(Lumpy skin disease virus,LS-DV)引起牛的一种重要疫病，临床表现以发热、皮肤水肿及局部坚硬的结节或溃疡为主要特征。

LSD 可导致乳牛产奶量减少、公牛暂时或永久不育、皮张利用价值大大降低。

发病率在2%~45%之间，致死率高达20%叫奶牛更为易感。

节肢动物的机械性间接传播被认为是LSDV传播的主要途径叫该病在跨境动物疫病中具有高影响力，被世界动物卫生组织(0IE)列为必须通报的疫病之一％
LSDV属于痘病毒科，与绵羊痘病毒和山羊痘病毒共同组成羊痘病毒属。

LSDV是双链DNA病毒，全基因组约由156个假定基因组成叫LSDV和其它痘病毒一样，病毒基因组由中间核心区域以及两端的反向重复序列组成，且羊痘病毒属各成员之间基因组序列高度同源。

血清学上很难将属内的各病毒成员加以区分，但通过感染动物的种属特性可以初步判断，同时必须结合多种诊断方法才能最终确定。

羊睾丸(LT)细胞、牛肌肉细胞、MDBK细胞及OA3.Ts细胞对LSDV较敏感心，可用于该病毒的分离。

本研究利用采自新疆伊犁地区临床疑似LSD症状的牛病变皮肤样本接种LT细胞，对产生细胞病变的培养物经透射电镜观察、间接免疫荧光检测、PCR检测、基因序列分析，结果表明分离到引起我国首次LSD疫情病毒株。

1材料与方法
1.1主要实验材料病变皮肤组织(病料)无菌采集自新疆伊犁地区发病牛。

LT细胞由本实验制备冻存。

细胞培养基为含10%FBS和2%双抗的MEM (Hyclone,美国)。

羊痘病毒阳性血清由本实验室制备。

用于病毒分离的LT细胞培养基含青链霉素浓度为10%(V/V)o病毒DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeSTAR®Max DNA Poly­merase购自TaKaRa公司；驴抗羊IgG-FITC二抗购自SIGMA公司。

本研究涉及的活病毒相关操作均在哈尔滨兽医研究所高等级生物安全III级实验室进行。

1.2病毒分离与滴定将无菌采集的病牛病变皮肤组织样品研磨后用含10%双抗的PBS重悬,5000r/min 离心10min,取上清接种LT细胞，37T,5%C02孵育lh,弃上清，用PBS洗3遍，补加10%FBS的MEM,继续培养至出现90%细胞病变(CPE)时，收获细胞培养物，将其反复冻融3次，5000r/min离心10min,收取上清病毒液按lO'-lO-7连续梯度稀释后，以每孔加100jiL的量加入96孔细胞培养板内，同时设立空白对照。

接种后连续观察6d,根据典型痘病毒细胞病变，按Reed-Muench法计算病毒半数感染量(TCID5o)o
1.3分离病毒的鉴定
1.3.1病毒粒子的形态学观察将上述上清病毒样品进行浓缩，按常规的负染方法固定染色、制备样片，利用透射电子显微镜(日立H-7650)观察病毒粒子形态。

1.3.2分离病毒株的间接免疫荧光试验(IFA)将1.2中收集的病毒液100倍稀释后，接种长满24孔板的单层LT细胞，培养72h后用4%多聚甲醛固定20min,以山羊痘病毒阳性血清(1：100)为一抗，驴抗山羊FITC-IgG(1:200)为二抗，进行IFA检测。

1.3.3分离病毒的PCR检测与测序根据LSDV TK 基因两翼序列(AF409137.1),采用01igo6.0软件设计引物：Forward primer(55844-55865)5'-TTGATGAAT ATAGCAACAAGCC-37Reverse primer(58275-58299) 5'-AATGATCTCTTAAGTATTTAATATG-3'o引物由吉林库美生物科技有限公司合成。

采用DNA提取试剂盒提取1.2中收集的病毒液总DNA,利用上述引物进行PCR扩增，反应体系：PrimeSTAR®Max DNA Polymerase10p,L;Forward primer和Reverse primer各1jjl L(10pmol);模板2|jl L;dH2O6jiL,共20|xL o PCR条件为：98X.10s,55X.15s,72£10min, 30个循环。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳初步判断为阳性后，由吉林库美生物科技有限公司测序后进行分析。

1.3.4分离病毒的全基因测序与系统进化分析将提取的总DNA基因组由北京诺禾致源科技股份有限公司进行二代测序(De novo),以Neethling LW病毒株(AF409⑶.1)作为参考序列。

测序完成后，用系统进化树分析(MEGA7.0)软件，与数据库中已知的
1060中国预防兽医学报2020年
所有病毒株（LSDV）全基因组进行比对分析，并构建进化树。

1.3.5分离病毒株的一步法生长曲线测定将分离病毒以感染复数（MOI）0.1接种长满6孔板的单层LT 细胞，每天收取细胞上清和等体积的的相应细胞裂解物，每个时间点设3个重复孔，测定TCHK,确定分离病毒生长曲线。

2结果与讨论
2.1病毒分离及电镜观察结果将研磨病料匀浆后的离心上清接种LT细胞进行病毒分离，用倒置显微镜逐日观察，第6（1观察到细胞明显地皱缩、变圆，即出现CPE。

待CPE达到90%时收取细胞，测定第_代病毒滴度,结果显示可达到1065TCIDso/mLo 有报道描述LSDV对LT细胞、牛肌肉细胞、MDBK 细胞或者OA
3.Ts细胞比较敏感，可以用于LSDV分离心。

但不同LSDV株对细胞的敏感度不同，有些LSDV株在分离时需要盲传几代才能出现CPE,有些接种后几天到十几天才能观察到CPE。

本研究中的病毒株在接种LT细胞第一代就观察到了CPE。

通过负染电镜观察，可见典型的砖型的痘病毒样粒子，直径为200多纳米。

LSDV的大小一般在290nmX 240nm[6],本研究中观察到的病毒粒子大小基本与之相符（图1）。

由于痘病毒在复制过程中会产生胞内成熟粒子（IV）和胞外病毒粒子（EV）问，所以要想观察到各种形态的病毒粒子需要样品中有大量病毒粒子，另外羊痘病毒在形态学上很难与正痘病毒区分，需采用其它方法进一步鉴定分离的病毒。

图1分离病毒株的透射电镜观察
Fig.1Electronmicroscopy visualization of negatively stained
LSDV
2.2分离病毒株的IFA结果由于LSD于2019年首次传入我国叫尚未有针对该病原的阳性血清，而羊痘病毒属中的各病毒成员之间同源性很高，血清学有很强的交叉反应冈，所以本研究选择其它羊痘病毒的血清作为检测血清。

将感染分离病毒72h后的LT细胞经IFA检测，结果显示，病毒感染细胞出现亮绿色荧光，而空白细胞无荧光（图2）,表明该病毒株可能为LSDV。

A:LT cells infected with the isolated LSDV strain;B:Mock
图2IFA结果
Fig.2Result of indirect immunofluorescence assay
2.3分离病毒株PCR检测结果提取病毒液DNA,以LSDV的TK基因两翼序列为模板设计特异性引物进行扩增，结果PCR扩增产物片段大小位于2000bp~3000bp,与预期LSDV基因组相应序列片段大小一致（图略）。

PCR产物测序结果显示，该PCR扩增片段与NCBI中LSDV相应片段的相似性为99.98%,进一步确定该分离株为LSDV,命名为LS・DV/China/Xinjiang/2019。

本研究以LSDV的TK基因两翼序列为模板，设计特异性引物进行扩增，由于GTPV,SPPV与LSDV基因序列同源性很高，所以必须要结合测序结果来判断。

2.4分离病毒株基因组序列分析将分离病毒株基因组DNA进行全基因组二代测序，所得序列与NC-BI中所有LSDV的基因组序列进行序列比对和系统进化树分析（MEGA7.0）,结果显示该分离株与LSDV/Russia/Saratov/2017序列相似性最高（99.42%）（图3）。

LSDV/Russia/Saratov/2017首次由俄罗斯分离，本次分离的病毒株与俄罗斯分离株一样，均能引起病牛发热和全身性结节等典型的临床症状a叫2.5一步法生长曲线分离病毒株接种LT细胞后，取各个时间点的LT细胞以及细胞上清样品进行病毒效价滴定，结果显示该分离病毒株在96h病毒效价达到最高，为lCTTCIDso/mL。

接种后4d~5d为病毒滴度的平台期（图4）。

该结果与文献报道的山羊痘病毒复制速度较慢的特点相符[叫
本研究通过对疑似LSD病牛的皮肤组织样品进行病毒分离，对分离物进行电镜形态学观察、免疫荧光学检测、PCR检测与基因组测序、病毒培养特性等系统分析结果表明，首次成功在我国分离到1
第10期张敏敏，等.我国首次牛结节性皮肤病病毒的分离鉴定1061
株LSDV,命名为LSDV/China/Xinjiang/2019o同源比对和系统进化树分析显示，本研究分离株与俄罗斯发现的LSDV/Russia/Saratov/2017株高度同源，后者能够引起典型皮肤结节等临床症状，分离样品采集地点距离哈萨克斯坦边境仅60km皿12],这些信息可为疫情溯源提供了重要线索。

结合流行病学情况叫我国新疆伊犁疫情最大可能为邻国传入，但以何种传播方式途径，有待进一步分析研究。

LS-DV/China/Xinjiang/2019的分离为我国LSD防控研究和技术研发奠定了基础。

-MH89376O.2Lumpy skin disease virus strain LSDV/Russia/Dagestan/2015 -MN642592.1Lumpy skin disease virus strain Kubash/KAZ/16
KX894508.1Lumpy skin disease virus isolate155920/2012
KY829023.3Lumpy skin disease virus isolate Evros/GR/15
KY702007.1Lumpy skin disease virus isolate SERBIA/Bujanovac/2016 AF409138.1Lumpy skin disease virus isolate Neethling vaccine Lw1959 AF325528.1Lumpy skin disease virus NI—2490isolate Neethling2490
MN072619.1Lumpy skin disease virus isolate Kenya
KX683219.1Lumpy skin disease virus strain KSGP0240Filed strains
Xinjiang/2019]
0.0010
MH646674.1Lumpy skin disease virus strain LSDV/Russia/Saratov/2017
MK441838.1Lumpy skin disease virus strain Herbivac LS batch008
AF409138.1Lumpy skin disease virus isolate Neethling vaccine LW1959
-KX764644.1Lumpy skin disease virus strain Neethling-Herbivac vaccine
MG972412.1Lumpy skin disease virus isolate Cro2016
KX764644.1Lumpy skin disease virus strain Neethling-Herbivac vaccine
KX764645.1Lumpy skin disease virus strain Neethling—LSD vaccine—OBP
Vaccine strains
图3系统进化树分析结果
Fig.3Phylogenetic tree analysis of LSDV nucleotide sequences
(Tw I Q O I bD Q Q o H
7
6
5
4
3
2
1
-•-Cell lysates Cell supernatants
0123456789
Days post infection
图4一步法生长曲线
Fig.4One-step growth curveof the isolatedvirus
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(本文编辑：彭永刚；英文编辑：
王海伟)。