高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910904696.3
(22)申请日 2019.09.24
(71)申请人 华兰生物工程重庆有限公司
地址 408000 重庆市涪陵区鹤凤大道66号
申请人 华兰基因工程有限公司　
华兰生物工程股份有限公司
(72)发明人 杨柳　张穹　刘利　郭心怡　
袁显棚　张宝献　周康森　李娅　
(74)专利代理机构 重庆中之信知识产权代理事
务所(普通合伙) 50213
代理人 刘强
(51)Int.Cl.
G01N 30/88(2006.01)
G01N 30/16(2006.01)
G01N 30/74(2006.01)
G01N 30/38(2006.01)
(54)发明名称高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法(57)摘要本发明公布了一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，采用磷酸盐缓冲液为流动相，该流动相的流速为0.6ml/min且进样量为20μl；按以下公式计算出静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与乙酰色氨酸峰面积之比：C x ＝(f X /f R )C R ，f X ＝A X /A S ，f R ＝A R /A S ；上式中，C x 为待测样品蛋白质含量；f X 为待测样品与内标物质峰面积比；f R 为对照品与内标物质峰面积比；C R 为待对照品蛋白质含量；A X 为待测样品所有组分峰面积；A R 为对照品所有组分峰面积，A S 为对内标物质峰面积。

其检测精度好，
效率高。

权利要求书1页 说明书3页CN 110632229 A 2019.12.31
C N 110632229
A
1.一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，采用磷酸盐缓冲液为流动相，该流动相的流速为0.6ml/min且进样量为20μl；
按以下公式计算出静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与内标物质乙酰色氨酸峰面积之比：
C x ＝(f X /f R )C R ，f X ＝A X /A S ，f R ＝A R /A S ；上式中
C x 为待测样品蛋白质含量；
f X 为待测样品与内标物质峰面积比；
f R 为对照品与内标物质峰面积比；
C R 为对照品蛋白质含量；
A X 为待测样品所有组分峰面积；
A R 为对照品所有组分峰面积；
A S 为内标物质峰面积。

2.根据权利要求1所述高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：所述色谱柱为亲水硅胶高效体积排阻色谱柱，色谱柱直径7.5mm，长60cm。

3.根据权利要求1所述高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液制备时，需量取0.5mol/L磷酸二氢钠200ml、0.5mol/L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15.5ml及水91
4.5ml，均匀混合。

4.根据权利要求1所述高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：内标物质制备时，称取乙酰色氨酸0.37g～0.41g于100ml容量瓶中，取浓度为1mol/L的氢氧化钠溶液溶解后，加纯化水80ml，并以1mol/L的盐酸溶液中和至pH7.0。

5.根据权利要求1所述高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：待测样品——静注人免疫球蛋白(pH4)取样时，精密量取静注人免疫球蛋白0.6ml，加入1.7ml所述流动相，再加入所述内标溶液0.2ml后混匀。

6.根据权利要求1所述高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，其特征在于：对照品——已知蛋白质含量静注人免疫球蛋白取用时，精密取已知蛋白质含量静注人免疫球蛋白(pH4)0.6ml，加入1.7ml流动相，再加入乙酰色氨酸内标溶液0.2ml 后混匀。

权　利　要　求　书1/1页CN 110632229 A
高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的
方法
技术领域
[0001]本发明属于静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量检测技术领域，尤其涉及一种静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的检测方法。

背景技术
[0002]目前，广泛使用的凯氏定氮仪法检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量，对准确取样有较高的操作要求，人为因素很大程度影响检测精密度；样品处理需沉淀蛋白质后收集滤液(非蛋白质氮)因其含量微量结果不稳定，影响检测结果准确性。

并且，检测时间长，从样品处理到上机测定一个样品大约需要5小时，能耗较高，样品消化需要开启功率为2500W消化炉3小时，定氮仪功率2200W需工作1小时，同时需开启自来水冷凝1小时。

发明内容
[0003]本发明的目的在于解决上述技术问题，提供一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，该高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法检测结果准确，效率高，能耗低。

[0004]本发明的技术方案如下：一种高效液相色谱仪检测静注人免疫球蛋白(pH4)蛋白质含量的方法，采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，采用磷酸盐缓冲液为流动相，该流动相的流速为0.6ml/min且进样量为20μl；
[0005]按以下公式计算出静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与内标物质乙酰色氨酸峰面积之比：
[0006]C x＝(f X/f X)C R，f X＝A X/A S，f R＝A R/A S；上式中，
[0007]C x为待测样品蛋白质含量；
[0008]f X为待测样品与内标物质峰面积比；
[0009]f R为对照品与内标物质峰面积比；
[0010]C R为待对照品蛋白质含量；
[0011]A X为待测样品所有组分峰面积；
[0012]A R为对照品所有组分峰面积；
[0013]A S为对内标物质峰面积；
[0014]本发明的有益效果：采用以上检测方法能有效减小因人员、仪器、方法等因素产生的误差和提高检查结果精密度。

同时，本法的主要步骤为样品定量稀释和定量加入内标物质，操作步骤简单，节约时间，单针采集时间为60分钟，样品检测时间共约2.5小时，且无高能消耗。

具体实施方式
[0015]以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明
书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

[0016]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
[0017]一、前期检测准备：
[0018]1、色谱条件构建：用亲水硅胶高效体积排阻色谱柱(SEC,排阻极限300kD,粒度10um)，柱直径7.5mm，长60cm。

以1％异丙醇的pH7.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(量取0.5mol/L 磷酸二氢钠200ml、0.5mol/L磷酸氢二钠420ml、异丙醇15.5ml及水914.5ml，混匀)为流动相，检测波长280nm，流速为每分钟0.6ml。

[0019]2、内标溶液：称取乙酰色氨酸约0.39g于100ml容量瓶中，用适量1mol/L氢氧化钠溶液溶解，加蒸馏水80ml后，以1mol/L盐酸溶液中和至pH7.0，用流动相定容样品。

[0020]3、样品处理：
[0021]供试品：精密量取静注人免疫球蛋白(pH4)0.6ml，加入1.7ml上述流动相，再加入乙酰色氨酸内标溶液0.2ml后混匀。

[0022]4、对照品溶液：精密取已知蛋白质含量静注人免疫球蛋白(pH4)0.6ml，加入1.7ml 流动相，再加入乙酰色氨酸内标溶液0.2ml后混匀。

[0023]二、蛋白含量检测：
[0024]1、具体检测方法：采用凝胶色谱柱，以紫外吸收检测器在280nm波长处检测，流动相流速：0.6ml/min，进样量：20μl，
[0025]2、检测结果计算：静注人免疫球蛋白(pH4)所有组分峰面积与乙酰色氨酸峰内标峰面积)之比
[0026]C x＝(f X/f R)C R
[0027]f X＝A X/A S；f R＝A R/A S
[0028]式中C x为待测样品蛋白质含量；
[0029]f X为待测样品与内标物质峰面积比；
[0030]f R为对照品与内标物质峰面积比；
[0031]C R为待对照品蛋白质含量；
[0032]A X为待测样品所有组分峰面积；
[0033]A R为对照品所有组分峰面积；
[0034]A S为对内标物质峰面积。

[0035]本检测方法依据分子排阻色谱法将待测组分的分子大小进行分离。

其原理是凝胶色谱柱的分子筛机制，色谱柱为亲水硅胶、凝胶和琼脂糖凝胶为填充剂，这些填充剂表面分布着不同孔径尺寸的孔，药物分子进入色谱柱后，他们中的不同组分按其分子大小进入进入相应的孔内，大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短，小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按照分子大小依次被洗脱。

被分离的各组分先后进入紫外检测器后根据蛋白质特征紫外吸收波长280nm 吸光度的改变而转换成电信号被仪器自动记录出色谱图。

[0036]被测样品分离的各组分均是蛋白质，所以应计算所有峰面积。

由于仪器稳定性和进样准确性均会引入检测误差，为此在样品中添加一性质稳定、不与样品发生反应、在280nm波长处有特征吸收的物质作为内标物，而N-乙酰-DL-色氨酸具有以上特性，进而用待
测样品和内标物质峰面积比进行计算则可消除以上误差。

[0037]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。

任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。

因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。