海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究

海水培养光合细菌存在的问题及其优化研究
摘要 [目的]为光合细菌海水培养技术的大规模应用提供理论依据。

[方法]采用对比试验研究光合细菌在不同培养基中的生长状况,探讨光合细菌在海水培养过程中出现沉降现象的原因,在此基础上对培养基组分进行优化并进行优化培养试验。

[结果]在海水培养光合细菌的过程中,酵母膏、蛋白胨培养基中沉降现象较轻,其余培养基中培养2 d后均出现较严重的沉淀现象,主要是因为培养过程中培养基的pH值逐渐升高,其中的磷酸盐与海水中的Ca2+和Mg2+结合成沉淀,从而使细菌附着在沉淀表面生长所致。

优化后的培养基组分为:乙酸钠3.0 g/L,氯化铵1.0 g/L,磷酸二氢钾0.1 g/L,酵母浸膏0.5 g/L。

[结论]用优化后的培养基培养光合细菌效果理想,培养7d后光合细菌的个数可达3.16@109个/ml。

关键词光合细菌;海水;培养
Problem of Photosynthetic Bacteria Culture in Seawater and Optimization of Culture Conditions
Abstract [Objective] The aimwas to provide theoretical basis for the application of culture technology for photosynthetic bacteria in seawater in large
scale. [Method] The contrast testwas taken to study the growth status of photosynthetic bacteria in differentmediums and to explore the reason of photo- synthetic bacteria appearing subsidence phenomenon inseawater in cultureprocess. Onthebasisof it, themediumcomponentswereoptimizedandtheop-
timized culturewas carried out. [Result] In the process of photosynthetic bacteria culture in seawater, the subsidence phenomenon in yeast extract and
peptone mediumwas slight and that in othermediumswas serious after cultured for2 d.Themainreasonwas that, withthe graduallyrise of pHvalue of
medium in culture process, the phosphate combined into precipitation with Ca2+andMg2+in seawater, so the bacteria attached to the precipitation to grown.. The optimized mediumwas that sodiumacetate of 3.0 g/L, chloride of 1.0 g/L, potassium dihydrogen phosphate 0.1 g/L, yeast extract 0.5
g/L. [Conclusion] The culture effect of photosynthetic bacteriawith optimized mediumwas ideal, and the number of photosynthetic bacteria could reach
3.16@109ind/ml after cultured for 7 d.
Key words Photosynthetic bacteria; Seawater; Culture
光合细菌(Photosynthetic Bacteria,PSB)是一类能在厌氧光
照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氧体兼碳源,进行不放氧
光合作用的有益细菌,不仅可作为光合作用机理和产氢固氮的
研究材料[1-2],且在养殖业、种植业、环境治理和新能源开发利
用等领域具有广阔的应用前景[3-8]。

在水产养殖中,光合细菌
可降解水体中的有机质和硫化物等有毒物质,实现其充当饵
料、净化水质、预防疾病和作为饲料添加剂等的功能,因此光合
细菌在无公害水产养殖中具有巨大的应用价值[10]。

目前生产
上应用较多的是紫色非硫细菌中的沼泽红假单胞菌(Rhodop
seudomonaspalusteris)和类球红细菌(Rhodobacter spheroids),市面
上所售菌种大都适合淡水培养,而用海水培养光合细菌时,因
为海水中含有大量的钙、镁等物质,极易与培养基中的PO43-、
HPO42-形成Ca3(PO4)2、CaHPO4等沉淀,导致细菌在沉淀表面生
长,出现严重的沉降现象。

为此,笔者进行了大量试验,找出了
适合光合细菌在海水中生长的培养基,并采用正交试验优化了
培养基中各组分的最佳配比,为光合细菌海水培养的大规模应
用奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种。

所用菌种主要是沼泽红假单胞菌,来源于江
西宜春强微高新技术专利开发中心。

1.1.2 仪器。

WFJ-72型可见分光光度计,PHS-3C型精密pH
计,YXQ-LS-50S立式压力蒸汽灭菌器。

1.1.3 培养基。

培养基选择试验采用5种培养基:小林达治
培养基的红螺菌科配方(培养基1)、Sawad培养基(培养基
2)、失木修身培养基(培养基3)、VanNiel培养基(培养基4)、
酵母膏、蛋白胨培养基(培养基5)[9]。

1.2 试验方法
1.2.1 5种培养基的比较。

将菌种以20%接种量接种到分
别用自来水和海水配制的上述5种不同的培养基中,在其他
因素(温度、光照、氧需求程度等)相同的条件下进行培养。

培养过程中每天震荡摇匀3~5次,在660 nm处测定菌液的
吸光度值(OD660)来表示菌体含量,并每天测定1次pH值,
以观察细菌培养繁殖过程中菌液的pH值变化。

图1 光合细菌在自来水中的生长曲线
Fig.1 The growth curve of photosynthetic bacteria in tap water
1.2.2 培养基组分的优化设计。

为解决海水培养光合细菌的
沉降凝聚问题,参照细菌在培养过程中所需要的碳源、氮源、磷
源和其他生长因子[4,9-12],结合海水的特点,对光合细菌生长
的培养基进行了改良,同时考虑各因素间的相互作用,采用正
交试验设计L8(27)[13],对培养基中各组分进行优化。

安徽农业科学,Journal ofAnhui Agri.Sci.2009,37(5):1901-1902,1918 责任编辑常俊香责任校对张士敏图2 光合细菌在海水中的生长曲线
Fig.2 The growth curve of photosynthetic bacteria in seawater
2 结果与分析
2.1 几种培养基的比较在淡水中,除VanNiel培养基和酵
母膏、蛋白胨培养基培养的PSB出现菌液颜色不正常(变成
橙红色),菌液发臭,菌体粘壁现象外,其他3种培养基培养
的PSB生长正常,菌液紫红,均匀、粘稠成胶体状,结果见图
1、图2。

出现这种现象的原因:从培养基的成分上看,5种培
养基的氮源都是氯化铵或硫酸铵,磷源都是磷酸二氢钾或磷
酸氢二钾,碳源有所不同。

VanNiel培养基和酵母膏、蛋白胨
培养基的碳源是蛋白胨,其他3种培养基的碳源主要是乙酸
钠。

乙酸钠作为小分子有机物,更适合光合细菌的生长,而
蛋白胨作为碳源出现上述现象可能是因为蛋白胨同时也是
其他菌种的营养物质,使其他菌种成为优势菌,PSB生长受
到抑制,出现菌液不正常现象。

在海水中,酵母膏、蛋白胨培养基沉降现象比较轻,但出
现了严重的粘壁现象,其余培养基均在2 d后出现严重的沉
降现象,后续生长缓慢。

这主要是由于其余4种培养基中都
含有不同量的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾,pH值的大小决定
了这些磷酸盐在培养体系中的存在形式,当pH值为6时,分
布系数DHPO42-=0.058,磷酸盐主要以HPO42-的形式存在;pH
值为8时,DPO43-=0.86,磷酸盐主要以PO43-的形式存在。

而
在PSB培养过程中培养基的pH值逐渐升高(培养第1~8 d
时,pH值分别为6.55、6.80、7.86、8.28、8.35、8.55、8.48、
8.79),磷酸盐主要以HPO42-和PO43-的形式存在,而HPO42-、
PO43-极易与海水中大量存在的Ca2+形成Ca3(PO4)2、CaHPO4
沉淀(Ksp Ca3(PO4)2=2.0@10-29,Ksp CaHPO4=1.0@10-7),
细菌就会附着在沉淀表面生长繁殖,造成菌液不均匀。

其
次,海水中含有较多的钙盐和镁盐,这些盐类的存在,破坏了
光合细菌胶体的稳定性,加剧了凝聚沉降现象的发生。

2.2 培养基组分的优化要防止菌悬液沉降,必须严格控
制培养基的pH值和磷源的加入量,为此,笔者在充分查阅相
关资料和初步试验的基础上[4,10-13],对光合细菌的培养基进
行了改良和培养基组分的优化(表1)。

从正交试验的直观分析结果来看,影响细菌生长的主要
表1 培养基各组分的正交设计L8(27)
Table 1 The design of L8(27) orthogonal test for each component in medium 列号
No. of
column
A
(乙酸钠)
Sodiumacetate
B
(氯化铵)
Ammonium chloride
C
(磷酸二氢钾)
Potassiumdihydrogen phosphate
D
(硫酸镁)
Magnesiumsulfate
E
(pH)C@E
F
(酵母浸膏)
Yeast extract
OD5-OD0
1 1(3.0) 1(1.0) 1(0.1) 1(0.0) 1(6.5) 1 1(0.5) 1.664
2 1(3.0) 1(1.0) 1(0.1) 2(0.5) 2(7.5) 2 2(1.0) 1.619
3 1(3.0) 2(2.0) 2(0.3) 1(0.0) 1(6.5) 2 2(1.0) 1.677
4 1(3.0) 2(2.0) 2(0.3) 2(0.5) 2(7.5) 1 1(0.5) 1.318
5 2(2.0) 1(1.0) 2(0.3) 1(0.0) 2(7.5) 1 2(1.0) 1.406
6 2(2.0) 1(1.0) 2(0.3) 2(0.5) 1(6.5) 2 1(0.5) 1.554
7 2(2.0) 2(2.0) 1(0.1) 1(0.0) 2(7.5) 2 1(0.5) 1.426
8 2(2.0) 2(2.0) 1(0.1) 2(0.5) 1(6.5) 1 2(1.0) 1.506
K16.348 6.213 6.185 6.043 6.272 6.064 6.132
K25.892 6.027 6.055 6.197 4.563 3.003 4.602
极差R0.456 0.186 0.130 0.154 1.708 3.061 1.530
因素主y次Factors ranking C@EEFAB D C
优方案Optimumscheme A1B1C1D2E1F1
注:OD0、OD5分别表示培养当天和第5天菌悬液在660 nm处的吸光度。

Note:OD0andOD5stand for the absorbency of bacterial suspension at the wavelength of 660 nm on the same day and the fifth day after culture.
因素是磷酸二氢钾和pH值的交互作用,其次是pH值,这与
前面的分析结果相吻合。

影响培养结果的因素依次为:C@E
yEyFyAyByDyC,由于硫酸镁的2水平之间没有显
著差异,海水中又含较多Mg2+(约1.29 g/L),所以最终选择
的优化方案是A1B1C1D2E1F1。

2.3 培养基组分优化后的培养效果用优化后的培养基对
光合细菌进行扩大培养,每天测定菌悬液的吸光度值
(OD660),并用乙酸和NaOH调节pH值在6.5~7.0之间。

同
时在相同温度、光照条件下,选择2种情况相比较:(1)选择优
化后的培养基,但在培养过程中不调pH值;(2)选择优化后
的培养基,但培养基中不加磷酸盐。

培养结果见图3。

由图3可知,用优化后的培养基培养的光合细菌生长状况
良好,7 d后用MPN法[14]测定光合细菌的个数达到3.16@
109个/ml。

用优化后但不调pH值的培养基培养光合细菌时,由
于2 d后菌液pH值升高,出现明显的沉降分层现象;优化后但
未加磷酸盐的培养基中虽然没有出现沉降分层现象,但菌体后
期生长缓慢。

可见磷源是PSB生长不可缺少的营养物质。

3 结论与讨论
影响细菌生长的主要因素是磷酸二氢钾和pH值的交互
(下转第1918页)
1902 安徽农业科学 2009年图3 不同品种番茄植株胞间CO2浓度
Fig.3 The intercellular CO2concentration of different cultivars of
tomato plants
3 结论与讨论
(1)品种是番茄生产的基础,是影响番茄产量的最重要
因素,而光合作用是番茄产量与品质形成的另一重要因素。

从光合作用与物质生产的角度看,番茄产量主要决定于光合
速率。

而光合产物能否有效分配到番茄植株各器官,则直接
影响番茄产量与品质的形成。

气孔是水分及气体进出的通
道,气孔导度是气体及水分进出的难易程度指标,胞间CO2
浓度是叶片光合作用反应底物[1]。

(2)该试验研究发现番茄植株上部、中部、下部叶片的净
光合速率、气孔导度和胞间CO2浓度,层性明显。

番茄净光
合速率程下降趋势,上部>中部>下部;胞间CO2浓度多呈
上升趋势,上部<中部<下部;气孔导度多呈下降趋势,上部
>中部>下部。

40号白果强丰净光合速率数值最大,其叶片
胞间CO2浓度与其他材料相反,下部>中部>上部。

这些均
为进一步研究番茄光合特性奠定了基础。

另外在该试验中
采用的是自然光,光照强度在不同单株间有一定差异,所以
针对此问题下一步将运用红蓝光源进行解决。

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(上接第1902页)
图3 不同情况下光合细菌的生长状况比较
Fig.3 The growth situations comparison of photosynthetic bacteria under different conditions
作用,其次是pH值。

优化后的培养基较适合用于光合细菌
的培养。

在用海水培养光合细菌的过程中,由于光合细菌
利用了培养基中的酸性物质或在生长过程中代谢产生碱性
物质,使菌悬液的pH值不断升高,所以要严格控制培养基
中磷酸盐的量,并保持pH值在6.5~7.0之间。

最佳培养
基组分配比为乙酸钠3.0 g/L,氯化铵1.0 g/L,磷酸二氢钾
0.1 g/L,酵母浸膏0.5 g/L,可不加镁盐。

用优化后的培养
基对光合细菌进行扩大培养,效果理想,可以在海水培养中
推广使用。

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