瑞氏木霉分子生物学研究进展

菌物系统１９（１）：１４７～１５２。

２０００
ｈ每ｅｏｓ辩证粥＃
璃氏本霉分子生物学霹究进展
汪天虹吴静邹玉霞
（出表丧擎赣生耱技术蕊索燕点舞赣察济南２５０｝∞｝
摘嬖：臻聂木霉（扛趟。

出，燃＃，辨群疗是瘩然舆中磐遍存在井嚣重要经满意义触一种丝按真
越。

从瑞氏木霉的转化系绽、基韪竞匿、基因袅达调控、过煮产生同源和异源重组蛋白等方面
对瑞氏木霉分子生物学研究进展情况进符了综述，
燕键词：瑞氏木霉，丝状真菌，转化系统，箍因赢隧．筵因袭达调控，重组蛋白
中霉分粪号：Ｑ９３３文献标识砖：Ａ文章箱弩：ｌ００７七５１５（２０∞）０１ｑｉ４７一稍５２
熬杖囊毽翔￡女融，＂嘏ｓ鼬是在各种气镞书麴±壤中普追存在的一静多缨貔真菝擞生姆，其中的一转媸鼹种类一瑞氏本霉（开妫。

如ｒ州ｎ，把掣ｉ），多卑泉，无论程学术研究或工业生产中，都被萼ｉ起广泛的饕避。

作为一种腐生真菌，瑞氏术霉能羊唾用多种碳源秘氯潦生长。

这种代鞋多样性搿盛翦具有的多条生物台戚岛降群途径，捷稃瑞氏永霉羹有产生多种帮壤辩敬缀拽谢产耪静能力。

潜对，由于瑶蠡本鬈辫典骞懿靛毋的势荽多释走努子赞覆撵解酶类辩能力，璃端袋本蒜棒搀工韭藿糖生产势簿事疑棱餐糖瓣懿簿粪，钰捂纾维煮酶。

睾纾维素酶鞋及蛩鑫穗、淀糟酶等，穗毒多年历史。

瑞菠本霉具有救好的台戒蓉翻朔势泌蒜白的毙力，如它所产生的～种主要的奸雅索麟一好维＝糖水解辩Ｉ（ｃｅｌ】ｏｂｉｏｈＹｄ酬ａｓｅ１），幽单拷贝基因编码，产量可选瑞氏术莓胞外分泌性萤白总鬣的５０％（ＤＩｌｒａ】ｍ，Ｐ』ｏｆ．．１９８８）。

另一个显著优点是瑞氏术霉舆有真校的分泌机制，根可能迸具有笥哺乳动物系统榴似的蛋白修饰性能，如：商甘鳝糖翟和Ｎ糖整他（Ｓａｌ哪ｕｏｄ，ｏ｝“．，１９８７）。

由于瑞茂术霉的蕊上优蘸性耨，船之其工啦亿规模发酵帑件菇跑较最熟，这些都往进了对瑞＆术霉酶遗传袭遣。

掏建璃螽术霉王妊纯重缓蛋自生产莲拣赫遗抟工程辨发麓，鸯强潦或异源努荽性蛋如的产生提供ｒ一象符之枣效的选经。

朝对予掏巢曲霉（却ｅ谤ｆ？冉辫”剐“岛ｗｓ）．搬挺然豫麓（弛“，ｏ妒ｏ，４ｃｄ瑚口）等模式真菌而言，瑞氏术攀是起步研究较魄的一种丝靛真菌，但在近十年来，对其势子生物学研究进展迅速．研究便Ｉ重点主要集中在术穗纤维素降簿代谢酶类的竟隆、表达．调控Ｅ。

率文试胰瑞陵本霉的转他系缝、基西竟隆、基霹表送调控、进薰产生碡蒜和弊源燕组簧自等方蔷对媾氏拳霉势子盘糖擎研究避展稽疆谶荐综述。

１转纯慈统
１．１营养缺麟型究耍棣
拄璃黄泰霉审还没有撵巅耱瞽遍赢篇瓣营莽缺陷墼变变转。

翔ｅｓｆ１９４７）、淑越越群ｎｆ｛争８５）秘＆硅牲躺．《ｌ净８７）等罄对ｔ，栉硭ｉ瓣分生豫芋遴暂繁舢诱变爱薅滤骥粕塞落分离霸罄窟了鬟要屎睫糖、色蘸酸线穗熬酸她营养软黪型突变撩。

篱墼糖燕酸的突变株艟教有救地寓豢培养。

将漩突变栋避～步置于补加鸟氯醴。

瓜氯酸或糖氯酸的ＭＭ葡萄糖培养基上培粹，筛选需要瓜氪酸才能生长的克曦株（认为鼹ａ嘴Ｂ一）用于进行转化实验，将需簧色氨酸的突变株进一步蛩于补加邻氨基荤甲酸、吲哚或色氨酸的川平板七培养．挑选黹要吲哚才能生长的竞随作为神ｃ窝室株。

基盒疆目：星家骞熟辩掌基金｛顼秘编号；∞７７∞｛２，
收稿日期：１９９８咖曲１５，骼璃日期ｚ１９８８一１１—２６
ＥⅧｌ：ｗｒＨ＠ｌＩｆｅｓ“ｊｄｕｃｎ
　万方数据
菌物景统９卷
ｌ。

２载体和转｛ｌ：纂绞
一个毒鼓的转化系统的建立，使碍在璇＆本攀串进行离繇和异搋摹禹表达的弭究成为可能。

瑞氏术霉转他系烧与其它墼状粪燕转｛￡系境基本糍钕。

一般使鬻细藩来源游蠡粒枸建的载体。

捌角ｒ糟Ｐ涮营葬缺酿型突变椿转变老摄莽型的转化，裁体懑常携带，圭ｎ越出Ｈ５蹴Ｂ或泖ｃ基露，蹦及Ⅳｆｒ郴５口ｐｙｒ４基霞，未见毫鼹源椽记系臻靛报道。

她辨，栗焉鼙牲标记鸽遣榉系巯已经建立，琶括挠性筛选：利用带有对蘸基糖管类抗生素拓潮霉素Ｂ秘（并｛８抗性筋摹露、赋予对金属稽靛寓苹霉索抗睫曲基因，鞋及对夫环内酯抗垒素寡霉素吴抗性静基蠢．缓和用来蛊ｓ扩帮船舶捕＃坩甜确ｌ矗ｓ细ｌ淞的祷草露索抗性基西（ｋｎ矗＃群赢，｛争９５，为选择标记，在含腐苹霉素的培养莲￡筛选转亿子；也可采带建立特殊代谢途径的方法虹剩用来鸯矗＾ｆ如缸”ｓ的ａｍｄｓ基疆，在敬乙酰胺为难一彝滞鹄培养萋上筛选转俄子。

谶上两类转讫系统率，戳ａ瑚ｄｓ基嚣或蒲草霉素抗链等为鼙性选择标记的系筑可应用于任何种类木罄，而戳营养缺褡型如阉描为基础的转讫系统，盔鞴面沈较局限，强能与ａｔ馨Ｂ一营养缺豁型瑞氏术霉菌株互补。

但这两类转｛艺俸幕的转化率都较高，可选１００～６∞个，¨ｇ（转亿子：转诧Ｄ小ｎ）。

转仡过程一般箍用建状真菌溶壁酶Ｎｏｖ艘ｙｎｌ２３４箭备僚生质体，在聚乙＝醇（ＰＥ（、）’山槊醇和氰化钙作用下进行质粒或ＤＮ鱼芹段莳转诧。

经过原生质体蒋生后在选择性培彝基上筛选转化子。

在Ｉ．ｏ～１２ｍｏｌ，Ｌ由黎醇存在ｆ，瑞氏禾霉豫生质体的再生率可达９０％。

ｎｎｍｊ茜Ｍ（１９８７）等的实验证萌，用可选择性的Ｄ小碱与上述基因避行菇转化，其共转化的频率相当高，可选绚８０％。

发现转化Ｄ】蚺整合到染色体上几个不同的位点，通常以多拷贝的重复形式在瑞氏术霉基鞭组中存在。

肄致转化ＤＮＡ整畲到染色体上的机制包括同源重组和非同繇照纽。

同源重组产生两种转化子：一种怒目的基因在染色体基西组中形成连锁的重复，一种是基因取代。

而非同源重组的转化子带有目的基因的非连锁的重复。

基蹰取代的方法已被多个实验室应用，“构建县各种新性状的瑞氏术霉工程苗（见本文第４部分）。

２基因克隆
２。

１基因觉瞪概况
自从ｓｈ（，ｅｍａｋｅｒ等用差异杂交法（ｓｈ∞ｍａｋｅｆＰ￡ａｌ，１９８３）惠隧了瑞氏本瓣纤维豢酶系的主要成势一外切葡聚纤维二审妻农壤酶ｌ（ｃＢ卜ｕ）基因以采，瑞氏木霉基因克隆艇究工作取得了迅速发鼹。

至今为止．克瞳并测序的瑞氏本糕基因已超过３０个，其中包括７个鲜维寨酶基因，ｌｏ个半磐维素酶基遇，与尿嚎畦台成有饕的两个基因：ｎｆａ５（缄码乳清酸磷酸核糖基转移酶）以及删（缠玛乳湾酝接苷七’一磷浆聪羧
酶＇、延眭圜于Ｔｅｎ基因、ｔ匕磁降勰镑阻暹蛋虫基因ｃ蝣ｌ、礴萄糖醛酸酶基因、磷酸甘浊酸激酶基困ｐｇ‰两个疏水疆自基鳗№！和ｈｆｂ２、５，８ｓｒＲＮＡ及被转录螅基雹阍序列煳ｔ秘ｌＴｓ２等。

是２克隆方法
早期势离端氏本霉的酶基匿营莱思差异杂交法，分别臻野维索嚣导条锌下马菲诱导条｛牟下辑提取抟ｍＲ№裁番ｅＤ姒探钟，与臻氏枣霉基疆文痒进行杂受，选择瘿些与翦者产生强烈荣交悉与嚣者不杂交啦甍落，从中簿选劐鲜维索酶基露。

其它尧隆基因曲方法包括：遗传踅｛｝祛，利用具有螺应营养蛱络型遗传背景蝇藓母莲作藉主薅选骶需的酵基瓣，船ｘｎＥｚｅｗｓｈ强￡ｆ８７（１９７７，ｂ）等利用带有熬敏感韵曲辩ｌ（娥玛ｘ∞台戒酶｝基霹熬醛裂酵母裁为宿主，努离了瑞氏本莓扮（玎Ｐ：Ⅸ一》甘露糖一卜磷靛鸟瞢靛转移酶懿ｃ凇基瓣；耧用抗棒懿免疫辨选法，弼ｕ糙ｊ锚。

样赢（１辨ｌ｝科用谈法扶瑞氏术霉ｃ静黼文
ｃｌ濂＃ｆ缸（｛９粥，ｂ）年日帮该法分离了瑞氏本霉静乙酰末痒串落选到海螺蔫聚糖酶ｌ基露。

胡，Ｍａｒ窑ｏｌｌｅｒ
聚糖鹜酶基因；异激杂囊法，剥角其它寞棱生耪相美静蓦西片段为探针瓣瑞簏术霉ｃＤＮＡ交露进行藩位
杂交筛选等；夏求遗传学法，由绳亿静酶鬣自得剥帮分懿基酸痔耐。

出托设计簿含成寡聚核苷酸程合物作为搽钎扶ｃｆ蝴文库串辩选新要翡酶基藩。

Ｋ曲ｉ对ｋ—孰仳￡Ｉ口≠．，（１９９１）用诧藩分离了瑞氏术霉的卦讶
　万方数据
麓聚糖纤雏二耱永解酶珏基鞫。

毽一般来说，逸些方麓对宿主苗的遗传背荣或菇它条件要求较高，方法
期汪天虹等瑞氏木撼分子生物学研究进展
繁琐，费时费力，耗资较高，而使基因￣克隆工作进展较慢，
｛９９碡年，翻酗ｇｅ＃ｆ藏，１１９９４｝发晨了一秘方法，裴够筏逮嚣考效撼分离墼获真蘑鲍繇差霆。

渡法是利用了椠些丝状真菌酶的ｅＤＮＡ鏊西能够在酵母启动子的接铷下，在酵母缅施中表达的特点，根据最敏而可倍的酶活力直接对丝状真菌的ｃＤＮＡ基因进行平板（包括固体平板章口９６穴平板ｍｊｃｒ。

６把ｒｐｌａ怔）活力分析翻筛选（Ｊ丑ｃｏｂｓ“ｄ，１９９４）。

当然，采嗣此方法的前挺必须是该酶基因能够在簿母细胞中表达，葺盈簿黄敏辩检测方法。

速静竟囊丝虢赛蓬酶莲嚣秘方洼撼教或翡建瑗乎努离臻琵本嚣翦蠹秘蘸聚糖酶基斟（ＳａｌｏｋｉｍｏＡＦ，Ⅱ，，１９９４）、Ⅸ—Ｌ阿拉怕呋喃糖苷酶基固（Ⅵ罐０１Ｉｅｓ—Ｃｌａｒｋ“＿，．，１９９６，ｃ）、￡陆州妇抽加ｓｏ忙月ｓ的葡浆糖酶基因和术聚糖酶基因（叫吣ｇｅｅｆ“，１９９４），本文作者也曾利用这一方装，撮撂受骞同时带寿外潦性末耱还鹱酶和末糖醇脱氢藓基因静重组酿酒酵母才嚣在以本糖为难一碳嚣的选择睫告成培养基上生长的特意，簌瑞氏木霉ＲｕｌＣ－３０的ｃＤＮＡ表选文库中成功地筛选剿臻氏木霉拳糖醇脱氯酶基因，并同时构建了能利用术糖的重组酿酒酵母（＝酲戈虹，１９９８）。

用传婉的方法分离调节基固，通常需要对相提的目的蛋白嚣详尽的了解，或能够得到相应的调节囊变撩鞋避荦萱突变互於窝耱，或需要了辩萁在痘落予上静结台位赢，然岳杀薅一步杂交法去巍瘫疆袍蛋白。

但在对设想的调节蛋岛没有任何了解的情况下，这些方法都不毹应用。

在酵母遗传学和分子生物学发屣的基础上，Ａｎｕｓａｌｏｈｅｉｍｏ（１９９７）等＾进一步发展了以酵母为基础的双载体克隆系统，以克隆术霉的纤维素酶调节壤困，该方法的原理是：首先用酵母报道基因Ｈ１ｓ３与ｒｒ髓ｓ缸ｃｂｈｌ的启动子相连后转诧营莽壤籍型簿簿蕊株，其上辩ｃｂｈｉ疟穗予建于是诱导篓囊番子，在菠寄ｅｂｂｌ赢魂予话诧蛋白存在懿蒲嚣＿Ｆ幂能启动报道基因在酵母中的表达。

｝５１；后用构建在酵母表达质粒置、在纤维紊上生长的７＝烨Ｐｊ“的ｃＤＮＡ文摩转化垃菌株，将转他子文库置雨禽组氨酸的培彝基上筛选，划只有带有ｒ惮ＰＪ“１１ｉｓ３越因或带有鳊羁ｃ磕ｌ盛旗子话毡虽囊麓霆的萤糖糍够存话。

用戤方法，成功戢簿选到两个瀵纯蛋白基嚣。

此方珐原理不但适用于分离真菌永解酶调节基霹，也可应用予任何真棱生耪其它调节基鞭静分离。

３基因的表达调控
３．１野壤漾与半野雏蔫蕃蠢翦表达满控
对瑞氏木霉产生的多种水解酶擞．尤其是纤蟪岽酶和半纾雄案酶基西的袭选已进行了广泛的研究。

至今为至，所研究过的瑞氏木霉基固蚀括７个纤维索酶基因：编码纤维二糖水解酶的ｃｂｈｌ、ｃｂｈ２和编码内橱蘩襄糖瓣豹ｅ謇ｌ，ｅ毋２、。

ｇｉ３，ｅｇｌ４，ｅ９５，７个半纤维豢莓基困：本壤糖酶基因ｘｙｎｉ和ｘｙｎ２。

本蟹昔酶基鼹ｂｘｌｌ、甘露糖藓基匿触ｎｌ、乙酰本聚耱酯酶基霞骶。

ｌ、ｐ葡萄塘霄辩基因昏ｒｌ峁ｇ一阿拉信臻穗糖瞢酶基嚣ａｂｎ，以及３个ａ半乳糖瞥酶基因Ａ刚．ａｇｌ２和耀１３。

这使得开厩在各种条件下有关水解酶产生的专一性和普遍性调节机制的研究成为可熊（ｐｃｎ龇ａ甜口ｆ，１９９７）。

霹野缝豢酶基霉Ｊ静攫静器究辖皋表氍，在辑慕臻粒诱导条锋下：在野雏絮，野维二赣、魏糖霸槐糖培养基上，遮些基因或多或步是铷同表述。

其中，ｃｂｈｌ表达最强。

程纤维紊和槐糖上，以及在“中性５碳源静油和山梨醇上．纤维素酶基因强表选。

对ｃｂｈｌ启动子的研究表明：槐糖的诱导与启动子上一段很短的序刊有关，强袭达可能由一个与ＴＡＴＡ禽靠近豹区段结台的调节鬣自所介导。

８在酵母系统中进行了有关ｅｂｈｌ窟动予活琵蛋盎耱薪究。

撬猿逆诱导许多拳拜维素酶基嚣的表达，簿控话籍醇诱导洚多基基。

包撬
纤维素酶趣目的表达，
Ｍａ嘴０１１ｅｓ刈ａｒｋ（１９９７）用各种嘉聚糖、单糖和多糖底物作为碳源，对１０个半纤维索酵基因的表达调控进行过糖强妁研究。

拳文作者也蒋摹援｝妇氆ｏｍ系刊杂交靛方法，对瑞氏本霉本精传谢凳键羲一本糖还原酶藕簸ｘｆ和末糖磐脱氢酶基雕ｘｄＨ在２０静幂同静碳潦（瞧括单一磺潦稚撬台碗深）ｊ二豹表达避符过类似的讲究，揭示了类似的结果（涎天虹，１９９９）。

由以上研究发现，奸蛙索酶、半纤维素酶、包括术糖代谢关键酶基因表达的～个普遍性髓是在葡萄椿　万方数据
培葬基上跫蘩显表达，其中攫多基嚣黪营蘸绔疆避孬彝ｌ是被一个瞢追牲蘩砖糖疆暹蛋南ｃＲ蜀甄奔零。

谤将系蔬９卷
遮一点可南臻氏术霉ｃ挥ｉｉ突受拣聚ｕｉｅ”００鞋葡萄禧墙嚣萋上穗为解阻遵菝态，毽把葑垒麓瑞筏零霉的ｃ他ｌｌ基落转化Ｒ吡ｃ一３０后，葡萄糖黻遇擞徽艇黼樽掰谜鞘《盯脚ｅｎＭＰｆｇｆ，．｝９９６），Ｃ疑ＥＩ蟹自谯ｅｂｈ｝寤秀子上曲鳍台谴点穗被确定，在捧幽蜜齄孛嚣黎冬葡萄糖繇暹部势有关，纤维素＋串野撬索域菠本糖代避麓铤酶蒸露虽然受葡萄糖强腿遏，键当培葬基串赣萄糖耗尽时，可以看到一般都毒一定程度凌运。

建释建军超诱导耪博撼下戆基端系乎寝这攥嚣了囊簿柱鑫拣条捧下赫生存。

已对ｉ＋５ｋｂ长的ｃ袖１上游痒制镪《序，熬上带番辜个垮旗＾￡山船凇葡萄糖阻遏西予Ｃ凇的绻台经点翱辩或穗救的６和谴点，臻ｅｂｈＩ主游越母麦努糖缮台蛩翻：：ｅ黼磁台嚣白辑避行辩继仓分辑粪验％ＤＮａｓｅＩ足迹分折实鞴指出，其中有４个位点被保护（毗ａｓｂｉｍａＰｆｏ？，１９９６）。

用系列缺必和精心设计的替代赛骚瓣究＿『２２辆长翦。

确｛瘩穑子去辕起嫱挺蠡Ａ下Ｇ主游一５∞鞋上懿接管鼗毒辩．鬻萄髓艇道簸解｜；采．在－７２０处一个单一的６ｂｐ序列５’Ｇ下０ＧＧｏ的凳臻足阱使解阻遏发生，这一位点与Ｒｃ—Ｆｖ括』ｄｅ驰谁谁糖醚邂蛋白ＭｌＧｌ默菠蝗牧鑫蓝蛐秘饕糖隧斑虽囊ｃＲ量Ａ，ｃ蟹≈援辩。

羲饕艘鞋避键点的去躲军影响挺耱的诱导作用（Ⅱｍｅｎ州砒１９晒）。

３’２调节蘩舞ｃＲ搬
瑞氏本霉静碳代谢物阻避蛋自ｃ袋猷融被觅隧《ｓ嘲ｍｓ蹦＃＃．，１９９５）。

霹ＣＲＥｉ的磷究鼯粜袭鹤，瑞裁拳霉耱鹫蒋糖匿遏壶其嘉ｅ强娄型镑撵绻掩，棼食酬蒸嚣寓饕子上蔫莓耱敏感攮点赫ｃ嬲簧舞辫穷警。

ｅ障ｌ窟劝子上带有７段序列，岛以前新篷别过时氲“ｊ赢抽蚶葡萄耱戳逼因子ｅＲＥＡ妁结台馈蠢挺麟。

在Ｏ＆档４｛４中，ｃｆｅｌ稳态难ＲＮＡ瑞警撼摆碳撩蕊变铊，在替萄耱培养基上低水平表达。

擞撵聪察绻粜分析，ｃ陀ｌ前表述Ｗ能为鲁律调节，
ＭａｃｈＲ￡ｆ】９９７）莓谖为：在酵母中，萼ｃ灶ｌ耧源瓣Ｍ昭ｌ萤趣是与ｓｓ鹣薛积糊Ｐｌ一起澎戚鞭迸袋舍体，解疆遗作用是幽ｓ硪莲戮缡妈蚋鬣尚撒辩搿调带。

孺在瑞氏木霉中掰掏爱，磷鼗纯彤式躺（始ｌ
登岛鼻褪斑翦共毒蓐捌５’ｓｖ《舔ＲＧ３’紧密缱窘。

蠹。

罅ｌ编码锌捺区和ＲＧＲｉ类识嚣瓣７鳓牺Ｄ斟Ａ嚣畿出麓构建的ＧｓＬ：ｃｋ】融台鬻幽，当用蛋自激酵Ａ的催化亚基磷酸诧，和用＿来自小牛胸腺的碱性磷酸酯酶去磷酸化聪，只有磷酸他灼融台赞岛岛棚废的＿；按有序刘结台。

出在葡萄糖上生长的培羚物得到的无继照抽挺钫，一旦去磷数祀，也蒋丧失形成（溉１专一惶酬Ａ镬宙戚复台体的能力。

最ｌ￡燃＃料缝产的瓣鞭糨毋源重缀蛋白
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ｌ期攫天虹等：瑞氏术霉分子生物学研究进展１５Ｉ４羹缎簧白的产生
瑞氏术霉的ｃｂｈＩ启动于是报强的启动子。

因此在对瑞氏术霉的遗传改造中，常刺糟ｃｂｈｌ启动予与终止序列构建转化裁体，将敞袭选的嚣白质结构基因插＾ｃｂｈＩ启动子与终』ｌ＝子序列烹阿。

然岳糟重蕴片袋转德照状粪蘸原生藤体。

翻褥基戮定链置挨整台的方法，将漆辅瓣莲因定谴整舍捌絷彘捧土，捷英在强麓璇予控秘下舞剥援ｃｂｈｌ的髓器敞序剥引导重组蛋自进行分泌姓裘迭，生产斯霭驹同辣或巽源滢白。

甩此方法融成功她构建了多种能３童链产生目的蛋白的熊状真蔚工程菌株。

表ｌ列出利用，：撑鼬ｆ生产的几种主要静同源和异嚣蕊国静悻撬。

奉文侔者新在触实鞋室在已巍建剽臻瘫本霉本糖醇聪氢穗藻羁舷基姑上，撼对琏袋术霉进耱落株改造，遴过蕊固定位鬟换熬窘，跛姆其枣糖醇脱氢酶基霹，搀建本糖辣生产蘸，此项工作藤在进萼亍中。

近年来的实验表明．瑞氏术霉不仅肄有适于蛋白生产的诸多优点，而且对人没有毒性，柱产酶条件下也不产生真菌毒索和抗生素。

经过基两工程手段改选的瑞氏术霉藏组荫株在走规模王业生产中箍安全无害鹣。

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