维生素A测定

标准曲线的制备
将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液（约
1mg/mL），制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其 准确浓度。标准浓度的标定方法 取维生素A和维生素 E标准液若干微升，分别稀释至10.00mL乙醇中，并分 别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数 计算该维生素的浓度。
测定条件
标准物 视 黄 醇 α —生育酚 γ —生育酚 δ —生育酚 比吸光系数 E1%cm 1835 71 92.8 91.2 波长λ ，nm 325 294 298 298
样品测定
提取：称样50g→加2%草酸100mL→入捣碎机中处理→过 滤→颜色若深可加白陶土 滴定：吸5mL样液→于三角瓶→用染料滴定至粉红色→15 秒内不褪色 计算： VC（mg/100g）=（V × T）/ W V -消耗染料体积（mL） T -1mL染料所能氧化维生素C的毫克数 × 100
分析步骤
皂化→提取→洗涤→萃取→浓缩→ 溶解→离心→测定→结果计算
样品前处理
1） 皂化
称取1－10g样品（含维生素A约3μ g)于皂化 瓶中，加30mL无水乙醇，进行搅拌， 直到颗粒 物分散均匀为止。加50mL 10％抗坏血酸，苯并 [e]芘标准液2.00mL，混匀。加10mL(1+1)氢氧 化钾，混匀。于沸水浴上回馏30min使皂化完全。 皂化后立即于水中冷却。
在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常 加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。
一、维生素A的测定
维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、 鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品 中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人 体内可转变为VA，故称为VA原。
一、 高效液相色谱法测定食物中VA、VE
高效液相色谱分析
预柱: ultrasphere ODS 10μ m, 4mm×4.5cm
分析柱:ultra25cm 流动相:甲醇:水＝98:2 混匀,于临用前脱气
紫外检测器波长：300nm
进样量：20μ L 流速：1.7mL/min
注意事项
（1）维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用 棕色玻璃仪器。 （2）在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。 （3）提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。 （4）洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。 （5）无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。 （6）在旋转蒸发时乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量损失。 （7）用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结 果偏低。
第二方法为纸层析法。
胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天 然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素， 其中在分子结构中含有 β 一紫罗宁残基的类胡萝卜素， 在人体内可转变为维生素A，故称为维生素A原。如α 、 β 、γ 胡萝卜素，其中以β —胡萝卜素效价最高。
β—胡萝卜素的结构如下：
48样品处理水果猕猴桃称量135g去皮加入一倍体积2草酸匀浆1min纱布过滤滤液定容至270ml2滴定标准维生素c溶液5mgml的测定取2mlvc溶液于锥形瓶中加入1ml淀粉液碘液滴定至蓝色出现30秒中内不褪色记下碘液体积v标准样品维生素c的测定取上述猕猴桃液10ml于锥形瓶中加入1ml淀粉液用碘液滴定至蓝色出现30秒内不褪色记下碘液体积v样品3计算10mgv标准样品mgv样品根据猕猴桃重量及滤液体积计算每100g猕猴桃中的vc含量
2）提取
将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50mL水 分2－3次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用 约100mL乙醚分两次洗皂化瓶及其残渣，乙醚液 并入分液漏斗中。如有残渣，可将此液通过有 少许脱脂棉的漏斗滤入分液漏斗。轻轻振摇分 液漏斗2min，静置分层，弃去水层。
3）洗涤
用约50mL水洗分液漏斗中的乙醚层，水洗至水
三、维生素C的测定
维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所 以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新 鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕 猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。 维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产 物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解 则生成2，3 -二酮古乐糖酸，失去生理作用。
标定二
吸5mL已知浓度V C标液 → 加5mL1%草酸 → 用染料2， 6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点 计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等 于滴定度（T） T= （C × V1）/ V2 C - 维生素C的浓度（mg/mL） V1 -维生素C的体积（mL）
V2 -消耗2，6-二氯靛酚的体积（mL）
胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以胡萝卜为食 物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而 添加胡萝卜素的食品也含有胡萝卜素。
胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气 中的氧可促进其氧化破坏。因系脂镕性维生素，故可用 有机溶剂从食物中提取。 胡萝卜素本身是一种色素，在450 nm 波长处有最大 吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物 体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取 β 一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此 在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方 法有纸层析、柱层析和薄层层析法。

净化用层析介质采用氧化镁、氧化铝 避光
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
四、维生素D的测定
维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，其中 最重要的是D2和D3。植物不含维生素D，但维生素D原 在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2 原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化 醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原， 在紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇。以D3 为最重要。 维生素D2 药片吃多了中毒。
二、比色法测定VA的含量
GB/T 5009.82—2003中第二法
原理
在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性 络合物，在 620 nm 波长处有最大吸收峰，其吸光度 与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。
三、β—胡萝卜素的测定
（GB/T 5009.83—2003 ）第一方法是HPLC；
维生素的测定
第一节 概
述
维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有 机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其 中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20 余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各 异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类， 还有的属于酚或醌类化台物。
在评价食品的营养价值，开发利用高含量维生素 的食品资源，指导人们合理调整膳食结构，指导制定 加工工艺或贮存条件，最大限量地保留各种维生素， 还要控制强化食品中加入量，防中毒，都离不开分析 检测工作。
GB/T 5009.82—2003中第一法 高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的 方法，此法能快速分离、同时测定维生素A和维生素E 最小检出量分别为VA：0.8ng；α -E：91.8ng；γ -E： 36.6ng；δ -E：20.6ng。
1.原理
食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后， 将其从不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC 法测定维生素A及维生素E的含量。
层不显碱性，（最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增 加）。
4）浓缩
将乙醚提取液经过无水硫酸钠（约5g）滤入 与球形蒸发瓶内，用约10mL乙醚冲洗分液漏斗及 无水硫酸钠3次，入蒸发瓶内，并将其接至旋转 蒸发器上，于55°C水浴中减压蒸馏并回收乙醚， 待瓶中剩下约2mL乙醚时，取下蒸发瓶，立即用 氮气吹掉乙醚。加入2.00mL乙醇，充分混合，溶 解提取物。将乙醇液移入一小塑料离心管中，离 心5min（5000rpm)。上清液供色谱分析。
标定一
吸标液（VC）5mL于三角瓶→加6%KI溶液0.5mL→加1% 淀粉3滴→用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色。 计算： 抗坏血酸浓度（mg/mL）=（V1×0.088）/V2 V1 - 滴定时消耗0.001N KIO3标液的体积（mL）
V2 - 维生素C重量（g）
0.088 -1mL 0.001N KIO3标液≈维生素C的量（mg/mL）
标准浓度计算：
X1 = A/E×1/100×10.00/(S×10-3)
式中：X1——维生素A浓度，g/mL；
A ——维生素A的平均紫外吸收值； S ——加入标准的量，μ L； E ——维生素A 1%比吸光值； 10.00/(S×10-3)——标准液稀释倍数
2）绘制标准曲线
标准和内标物进行色谱分析，以维生素A峰 面积与内标物峰面积之比为纵坐标，维生素A 浓度为横坐标绘制标准曲线。
2、试剂
⑴ 1%草酸溶液：称取10g草酸，加水至1000mL； ⑵ 2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000mL； ⑶ 维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀 释至100mL，吸5mL于50mL容量瓶中，加入1%草酸至刻 度，此溶液每毫升含有0.02mgVC； ⑷ 0.02% 2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg， 溶于200mL含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释 至250mL，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程 中每星期标定一次。
分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。 是AOAC选定的正式方法。
维生素D的结构
(一)三氯化锑比色法
原理 在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合 生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈 正比。

食品中维生素D含量较低，其他维生素严重干扰 其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。 层析介质为硅藻土、中性氧化铝 此法测定的是维生素D2和维生素D3的总量
水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿 等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热 也不破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别 在碱性条件下加热，可大部分或全部破坏。它们易受 空气、光、热、酶、金属离子等的影响； 维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光 线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。
3、耐热、耐氧化性
VA
耐热性 好，能经受煮沸 好，能经受煮沸
好，能经受煮沸
氧化性 易被氧化 （光、热促进其氧化） 不易被氧化
在空气中能慢慢被氧化 （光、热、碱促进其氧化）
VD
V
E
根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常： 皂化样品 水洗去除类脂物 提取脂溶性维生素(不皂化物) 溶于适当的溶剂 测定。 有机溶剂 浓缩

(二) 液相色谱法
它的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便， 精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方 法。 试样经皂化后，用苯提取不皂化物，蒸馏除苯， 先采用反相C18柱分取维生素D，除去大部分杂质。 进一步采用正相色谱分离，紫外检测定量。


反相色谱条件 色谱柱：Nucleosil C18,7.5mm*300mm 流动相：乙腈＋甲醇（1＋1） 流速：2.0 mL/min 紫外检测波长：254nm 正相色谱条件 色谱柱：正相柱Zorbax SIL,4.5mm*250mm 流动相：0.4%异丙酮的己烷溶液 流速：1.6 mL/min 紫外检测波长：254nm
维生素分类：脂溶性（A、D、E、K） 水溶性两类（B族、C）
第二节 脂溶性维生素的测定
VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时可 吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质： 1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、 乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。
2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱稳 定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性 气体保护下，也能经受碱的煮沸。
根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。常用 的测定方法有 （1）2，6-二氯靛酚法 （还原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法 （总VC） （3）碘酸法 （4）碘量法 （5）荧光分光光度法
(一) 2，6—二氯靛酚滴定法
1．原理 还原型抗坏血酸可以还原染料2，6-二氯靛酚。该 染料在酸性溶液中呈粉红色(在中性或碱性溶液中呈 蓝色)，被还原后颜色消失。 还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢 抗坏血酸。在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液 还原标准染料液的量，与样品中抗坏血酸含量成正比。
注意事项

1、VD2 与VD3分不开
2、皂化时加入焦性没食子酸作为抗氧化剂 2、标样与试样在同样条件下皂化，消除了VD的热 异化性损失。 3、也可用硅藻土及皂土柱层析，除去甾醇、VA、 胡萝卜素的干扰。

第三节 水溶性维生素的测定
水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组 织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性 质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都 会从小便中排出。为避免耗尽，需要经常由饮食来 提供。