T型Ca-%272%2b-通道在逼尿肌兴奋产生及逼尿肌不稳定发生机理中作用研究

第三军医大学博士学位论文
Ｔ型Ｃａ２＋通道在逼尿肌兴奋产生及逼尿肌
不稳定发生机理中的作用研究
摘要
逼尿肌不稳定（Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）是最常见的一种膀胱功能障碍，病因多样，发病率高，治疗困难，常引起尿频、尿急、急迫性尿失禁等临床症状，严重者导致肾、输尿管积水和肾功能损害，给患者精神及经济上造成极大的负担。

ＤＩ发病机理尚不清楚，争论主要集中在ＤＩ发生是神经源性还是肌源性。

最近资料显示ＤＩ与逼尿肌自发兴奋能力增强有关，发生ＤＩ的最终环节是肌细胞的兴奋性增高，是一种肌源性兴奋性改变。

逼尿肌细胞是～种可兴奋细胞，其兴奋的产生受多种因素调控，但Ｃａ２＋在其中起着最关键的作用；逼尿肌细胞兴奋的前提是Ｃａ２＋内流入胞，导致膜电位发生改变，使电压依赖式离子通道激活，细胞去极化；同时，ｃａ２＋发挥第二信使作用，激活其它ｃａ２＋依赖式离子通道与受体，共同参与细胞动作电位的引发。

Ｃａ２＋通道是Ｃａ２＋入胞的主要途径，逼尿肌细胞膜上有高密度的Ｌ型Ｃａ２＋通道，据此临床上应用Ｌ型ｃａ”通道阻断剂治疗ＤＩ，虽取得了一定疗效，但并不能消除ＤＩ的发生。

Ｔ型Ｃａ２＋通道是一种低电压激活的ｃａ２＋通道，门控行为具有快速失活和缓慢关闭的动力学特性，可在细胞静息电位水平形成“窗口”电流，促进膜的去极化作用，在细胞兴奋启动阶段发挥重要作用；同时，Ｔ型Ｃａ２＋通道的三个亚型ｎ１Ｇ、ｄｌＨ和ＯｌＩ具有各自的“门控”特性，功能上互有差异。

业已证实Ｔ型ｃａ”通道对心肌起博细胞、神经元细胞的兴奋起着关键作用，某些兴奋性增加的病理状态的产生也与Ｔ型Ｃａ２＋电流密度增强有关。

目前ＤＩ逼尿肌细胞兴奋性变化是否与Ｔ型ｃａ２＋通道的结构与功能异常有关尚未见研究报道，有关Ｔ型Ｃａ２＋通道在正常逼尿肌兴奋产生中的作用仅在近年才有零星的报道。

（２００１年）发现逼尿肌细胞还存在Ｔ型ｃａ”跨膜电流，肌条实验（２００３年）表明阻断Ｔ型Ｃａ２＋通道后逼尿肌兴奋性明显下降。

为此，我们从下面几个方面进行了研究：第一，对常用的ＤＩ研究模型（膀胱出口梗阻模型，ＢＯＯｍｏｄｅｌ）进行尿动力学上的动态监测，评估模型的最佳选择时期，在此基础上采用ＲＴ－ＰＣＲ法分析ＤＩ逼尿肌组织中Ｔ型ｃａ”通道亚型的表达，了解Ｔ型ｃａ２＋通道是否可成为ＤＩ发生的原因；第二，采用急性分离逼尿肌细胞，应用膜片钳技
术的电压钳记录模式，记录与分析ＤＩ逼尿肌细胞是否存在Ｔ型ｃａ２＋电流的异常变化，探讨ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型Ｃａ２＋电流的动力学特性及其对细胞兴奋性的影响；第三，采用急性分离逼尿肌细胞，应用膜片钳技术的电流钳记录模式，记录与分析Ｃａ２＋通道阻断剂（Ｌ与Ｔ型）对ＤＩ逼尿肌细胞动作电位的影响，探讨Ｔ型ｃａ２＋通道与ＤＩ逼尿肌兴奋性之间的关系，以及Ｔ型ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ的可行性，为临床应用新型Ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ提供理论指导。

主要结果和结论如下：
１．发现ＤＩ逼尿肌细胞与正常逼尿肌细胞均有Ｑ．Ｉ亚型表达，且表达量上两者无显著的差别；发现ＤＩ逼尿肌细胞出现了ａ１Ｇ亚型的表达，而正常逼尿肌上无此亚型表达。

推测ＤＩ逼尿肌中ａ１Ｇ亚型的异常表达可能与ＤＩ逼尿肌细胞电位变化及机制中发挥了重要作用。

２．发现Ｔ一型Ｃａ２＋通道与Ｌ型Ｃａ２＋通道共同参与了逼尿肌细胞动作电位的形成。

这一发现为认识逼尿肌细胞Ｃａ２＋通道参与的细胞动作电位形成提供了实验依据。

３．发现Ｔ型Ｃａ２＋通道在逼尿肌细胞起到了维持细胞膜电位、阈电位的作用，与动作电位的启动和重复发放密切相关。

这一发现提示；Ｔ型ｃａ２＋通道在逼尿肌细胞兴奋产生机制中起着关键性的作用。

４．发现ＤＩ逼尿肌细胞产生动作电位的能力特别是连续动作电位发放的能力明显强于对照的稳定逼尿肌细胞，进一步证实了ＤＩ发病是逼尿肌细胞本身兴奋能力增强的结果，为ＤＩ发生的肌源性学说提供了有力证据。

５．证实了逼尿肌存在着Ｔ型ｃａ”通道表达；发现ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型ｃａ”电流密度明显强于稳定的逼尿肌细胞，Ｔ型Ｃａ２＋内向电流增大是ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型Ｃａ２＋通道活动的基本特征。

６．发现Ｌ型Ｃａ２＋通道在ＤＩ发生机制中不起主导作用，Ｔ型Ｃａ”通道起着关键作用，提示应用Ｔ型Ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ理论上可行。

关键词：膀胱；逼尿肌细胞；梗阻；逼尿肌不稳定｛尿动力学；病因学
全细胞膜片钳；钙内流；钙通道：钙通道阻断剂：动作电位
ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆＴ．ｔｙｐｅＣａ２．＋ｃｈａｎｎｅｌｓｉｎｔｈｅ
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ｐｒｏｖｉｄｅｒｓ．Ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｕｒｉｎａｒｙｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ｕｒｇｅｎｃｙａｎｄｕｒｇｅｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ．ａｎｄｅｖｅｎｌｅａｄｓｔｏｈｙｄｒｏｎｅｐｈｒｏｓｉｓｏｒｈｙｄｒｏｕｒｅｔｅｒｈｙｄｒｏｕｒｅｔｅｒｏｎｅｐｈｒｏｉｓｓ，ａｎｄｔｈｅｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｏｓｅｓｅｒｉｏｕｓＣａＳｅＳ．Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｈａｓｆｅａｔｕｒｅｓａｓｖａｒｉａｎｔｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓ，ｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｐｏｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｕｔｃｏｍｅｓｅｔｃ．Ｔｈｅｅｘａｃｔｅｔｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
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ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｉｔｃａｎｔ’ｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｅｒａｓｅｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
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第三军医大学博士学位论文
ｓａｍｅｔｉｍｅ．Ｔ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｈａｓｔｈｒｅｅｉｓｏｆｏｒｍｓ（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）ｏｆｏ１Ｇ、ｏＩＨａｎｄｏ１Ｉ，ａｎｄｔｈｅｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｍａｎｉｆｅｓｔａｔｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｂｏｔｈｇａｔｉｎｇｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＩｔｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅＴ－ｔｙｐｅＣａ‘＋ｃｈａｎｎｅｌｐｌａｙａｋｅｙｒｏｌｅｆｏｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｔｈｅｃａｒｄｉａｃｐａｃｅｍａｋｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄｓｏｍｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓａｌｓｏｅｘｉｓｔｅｄｗｉｔｈａｎｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴ，ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｕｒｒｅｎｔ．
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ｄｒａｓｔｉｃａｌｌｙ
Ｗｅｃａｒｄｅｄｏｕｔｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｓｆｏｌｌｏｗｓ：Ｆｒｉｓｔ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｍｓｏｒａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ（ＢＯＯｍｏｄｅｌ）Ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｒｅｇｕｌａｒｕｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅｎｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｅｒｉｏｄｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｍｏｄｅｌｗａｓ
ｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＴ—ｔｙｐｅＣａ计ｃｈａｎｎｅｌｓｂｅｔｗｅｅｎ
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ｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈｔｈｅｅｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｔｈｅｓｅｃｕｒｒｅｎｔｓｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ；Ｔｈｉｒｄ，ＴｈｅＴ—ｔｙｐｅＣａｚ’ｃｕｒｒｅｎｔｓｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｓａｆｔｅｒｔｈｅａｄｄｔｉｏｎｏｆＣａ‘＋ｃｈａｎｎｅｌｓｂｌｏｃｋｅｒｓ（ｂｏｔｈＬａｎｄＴｔｙｐｅ）ｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄｖｉａｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐｏｎｔｈｅｆｒｅｓｈｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅｄｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＴ．ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗ：
１．ＴｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓｏｌＩｉｓｏｆｏｒｍｂｏｔｈｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｗｉｔｈｏｕｔｑｕａｎｔｉｔｙｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙｗｈｉｌｅｏｉＧｉｓｆｏｕｎｄｏｎｌｙｉｎｔｈｅｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．２．ＯｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｐｒｏｖｅｓｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｉｓｆｏｒｍｅｄｂｙｂｏｔｈＬａｎｄＴｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓ．
ａｎｄｔｈｒｅｓｈｏｌｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ３．Ｔ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓｐｌａｙｔｈｅｒｏｌｅｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｎｄｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｅｐｅａｔｅｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
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５．ＴｈｅＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｕｒｒｅｎｔｓｄｅｓｉｆｉｅｓａｒｅｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔｓａｒｅｔｈｅｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｆｅａｔｕｒｅｏｆＴ—ｔｙｐｅＣａ”ｃｈａｎｎｅｌｋｉｎｅｔｉｃｓｉｎｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓ．６．ＩｔｉｓｔｈｅＴ—ｔｙｐｅＣ一＋ｃｈａｎｎｅｌｓｎｏｔＬ－ｔｙｐｅｔｈａｔｐｌａｙｔｈｅｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｉｔｉｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙｆｅａｓｉｂｌｅｔｏａｐｐｌｙｔｈｅＴ—ｔｙｐｅｃａ２＋ｃｈａｎｎｅＩｂｌｏｃｋｅｒｓｔｏｔｒｅａｔｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｕｒｉｎａｒｙｂｌａｄｄｅｒ；Ｄｅｔｒｕｓｏｒｃｅｌｌｓ；Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；
Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ；Ａｅｔｉｏｌｏｇｙ；Ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌＰａｔｃｈＣｌａｍｐ；ｃａ２＋ｉｎｆｌｕｘ；
Ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ；ＣａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｂｌｏｃｋｉｎｇＡｇｅｎｔｓ；Ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．
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秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。

论文作者签名：７五：ｉ纭日期：趁丝！：７
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Ｒｏｔａｔｅｐｅｒｍｉｎｕｔｅ
Ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌ
Ｔｅｓｔｐｏｔｅｎｔｉａｌ
Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｙ
ＶｏｌｔａｇｅｄｅｐｅｎｄｅｎｔＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓ
动作电位波形
碱基对
前列腺增生症
膀胱出口梗阻
逼尿肌不稳定
逼尿肌细胞
逼尿肌稳定
改良基础培养基
胎牛血清
高电压激活
钳制电压
国际尿控协会
低电压激活
最大膀胱容量
磷酸盐缓冲液
多聚酶链反应
逆转录多聚酶链反应
每分钟转速
平滑肌细胞
检测电压
尿动力学检查
电压依赖性钙通道
第三军医大学博士学位论文
ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｒｏｌｅｏｆＴ．ｔｙｐｅＣａ２．＋ｃｈａｎｎｅｌｓｉｎｔｈｅ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｃｏｎｌｎｌｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｂｌａｄｄｅｒｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｃａｕｓｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｍｏｒｂｉｄｉｔｙｉｎｓｕｆｆｅｒｅｒｓａｎｄａｇｒｅａｔｆｉｎａｎｃｉａｌｅｘｐｅｎｓｅｔｏｈｅａｌｔｈｃａｌ－。

ｐｒｏｖｉｄｅｒｓ．Ｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｕｒｉｎａｒｙｆｒｅｑｕｅｎｃｙ，ｕｒｇｅｎｃｙａｎｄｕｒｇｅｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ．ａｎｄｅｖｅｎｌｅａｄｓｔｏｈｙｄｒｏｎｅｐｈｒｏｓｉｓｏｒｈｙｄｒｏｕｒｅｔｅｒｈｙｄｒｏｕｒｅｔｅｒｏｎｅｐｈｒｏｉｓｓ，ａｎｄｔｈｅｉｍｐａｉｒｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｎａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｓｉｎｔｈｏｓｅｓｅｒｉｏｕｓＣａＳｅＳ．Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｈａｓｆｅａｔｕｒｅｓａｓｖａｒｉａｎｔｅｔｉｏｌｏｇｉｅｓ，ｈｉｇｈｉｎｃｉｄｅｎｃｅａｎｄｐｏｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｕｔｃｏｍｅｓｅｔｃ．Ｔｈｅｅｘａｃｔｅｔｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｕｎｗｉｎｄｅｄａｎｄｔｈｅｍａｉｎｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙｉｓｆｏｃｕｓｅｄｏｎｗｈｅｔｈｅｒｉｔｉｓｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃｏｒｍｙｏｇｅｎｉｃｃａｕｓｅｓ．Ｔｈｅｌａｔｅｓｔａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｅｖｉｄｅｎｃｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｄｅｔａ＇ｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｓｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒａｎｄｔｈｅｅｎｄｓｔａｇｅｏｆｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｓｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｂｅｌｉｅｖｅｄｔｏｂｅｄｕｅｔｏａｍｙｏｇｅｎｉｃａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ．
Ｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｉｓａｓｏｒｔｏｆｅｘｃｉｔａｂｌｅｏｎｅ，ａｎｄｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｉｓｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙａｖａｒｉｅｔｙｏｆｆａｃｔｏｒｓ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈｔｈｅＣａ”ｓｉｇｎａｌｐｌａｙｓａｋｅｙｒｏｌｅ．ＴｈｅｐｒｅｍｉｓｅｏｆｅｘｃｉｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｉｓｔｈｅｉｎｆｌｕｘｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ”ｉｏｎ，ｔｈｅｎｌｅａｄｓｔｏｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｍｂｒａｂｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｓｔｈｅｖｏｌｔａｇｅ·ｇａｔｅｄｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓ，ａｎｄｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ，ｏｔｈｅｒＣａ２＋＿ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｏｎｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｌｓｏａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＣａ２＋ｉｏｎ，ｓｅｒｖｉｎｇａｓａｓｅｃｏｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒ，ｊｏｉｎｔｌｙｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．ＴｈｅｉｎｆｌｕｘｏｆＣａ２＋ｉｏｎｉｎｔｏｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｓｍａｉｎｌｙｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｂｙｗａｙｏｆｔｈｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｈｅｒｅａｒｅｄｅｎｓｅＬ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓｉｎｔｈｅｄｅｔｒｕｓｏｒｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｂｏｖｅｅｖｉｄｅｎｃｅ．ｔＩｌｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｈａｓｌｏｎｇｂｅｅｎｐｕｔｆｏｒｗａｒｄｃｌｉｎｉｃａｌｌｙｉｎｔｈｅⅡｅａｔｒｎｅｍｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｔｈｏｕｇｈｔｈｉｓｋｉｎｄｏｆｔｈｅｒａｐｙｃｏｕｌｄａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｏｍｅ
ｓｙｍｐｔｏｍｓ，ｉｔｃａｎｔ’ｔｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙｅｒａｓｅｔｈｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
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ｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｒａｎｇｅ，ｉｔｃａｎｐｒｏｄｕｃｅａ“ｗｉｄｏｗ’’ｃｕｒｒｅｎｔｔｈａｔｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄｐｌａｙｓａｖｉｔａｌｒｏｌｅａｔｔｈｅｓｔａｇｅｏｆｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ａｔｔｈｅ
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ｓａｍｅｔｉｍｅ．Ｔ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｈａｓｔｈｒｅｅｉｓｏｆｏｒｍｓ（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）ｏｆｏ１Ｇ、ｏＩＨａｎｄｏ１Ｉ，ａｎｄｔｈｅｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｍａｎｉｆｅｓｔａｔｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｂｏｔｈｇａｔｉｎｇｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＩｔｈａｓｂｅｅｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅＴ－ｔｙｐｅＣａ‘＋ｃｈａｎｎｅｌｐｌａｙａｋｅｙｒｏｌｅｆｏｒｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｔｈｅｃａｒｄｉａｃｐａｃｅｍａｋｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｎｅｕｒｏｎｓ，ａｎｄｓｏｍｅｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｉｒｃｕｍｓｔａｎｃｅｓａｌｓｏｅｘｉｓｔｅｄｗｉｔｈａｎｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＴ，ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｕｒｒｅｎｔ．
Ａｔｐｒｅｓｅｎｔ，ｉｔｈａｓｎｏｔｂｅｅｎｃｏｖｅｒｅｄｗｈｅｔｈｅｒｔｈｅｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｔｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｎｄｄｉｓｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＴ－ｔｙｐｅＣａ”ｃｈａｎｎｅｌ．ＲｅｌｅｖａｎｔｏｄｄｓａｎｄｅｎｄｓｒｅｐｏｒｔｓａｂｏｕｔｔｈｅｒｏｌｅｏｆＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｗａｓｃｏｖｅｒｅｄｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｅｘｃｉｔａｔｉｏｎａｔｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃ：ｙｔｅｓｉｎｔｈｅｒｅｃｅｎｔｌｙｙｅａｒｓ．Ｉｎ２００１ｙｅａｒ，ｉｔｗａｓｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｔｈａｔｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｗａｓｐｒｅｓｅｎｔｗｉｔｈＴ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｓｐａｎｍｅｍｂｒａｎｃｅｃｕｒｒｅｎｔ，ａｎｄｉｎ２００３ｙｅａｒ，ｍｕｓｃｌｅｓｔｒｉｐｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｐｒｏｖｅｄｔｈｅｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄｂｙｔｈｅａｄｄｉｔｉｏｎｏｆＴ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｂｌｏｃｋｅｒ．
ｄｒａｓｔｉｃａｌｌｙ
Ｗｅｃａｒｄｅｄｏｕｔｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｓｆｏｌｌｏｗｓ：Ｆｒｉｓｔ．Ｔｈｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｍｓｏｒａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌ（ＢＯＯｍｏｄｅｌ）Ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｒｅｇｕｌａｒｕｒｏｄｙｎａｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｈｅｎｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓｒｅｓｕｌｔ，ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｅｒｉｏｄｆｏｒａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｍｏｄｅｌｗａｓ
ｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＴ—ｔｙｐｅＣａ计ｃｈａｎｎｅｌｓｂｅｔｗｅｅｎ
ｗｅｒｅｐｒｏｂｅｄｕｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｔＯｓｅｅｉｆＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓｃｏｕｌｄｂｅｔｈｅｅｔｉｏｌｏｇｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；Ｓｅｃｏｎｄ，ＴｈｅＴ—ｔｙｐｅＣａ”ｃｕｒｒｅｎｔｓｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄｖｉａｐａｔｃｈ—ｃｌａｍｐｏｎｔｈｅ
ｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｗｉｔｈｔｈｅｅｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｏｌｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄ
ｔｈｅｓｅｃｕｒｒｅｎｔｓｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙ；Ｔｈｉｒｄ，ＴｈｅＴ—ｔｙｐｅＣａｚ’ｃｕｒｒｅｎｔｓｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｔｈｅａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｕｒｒｅｎｔｓａｆｔｅｒｔｈｅａｄｄｔｉｏｎｏｆＣａ‘＋ｃｈａｎｎｅｌｓｂｌｏｃｋｅｒｓ（ｂｏｔｈＬａｎｄＴｔｙｐｅ）ｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄｖｉａｐａｔｃｈ－ｃｌａｍｐｏｎｔｈｅｆｒｅｓｈｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅｄｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙａｎｄｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆＴ．ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗ：
１．ＴｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｒｅｉｓｏｌＩｉｓｏｆｏｒｍｂｏｔｈｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌａｎｄｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｗｉｔｈｏｕｔｑｕａｎｔｉｔｙｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙｗｈｉｌｅｏｉＧｉｓｆｏｕｎｄｏｎｌｙｉｎｔｈｅｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｔｉｓｓｕｅｓｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇａｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．２．ＯｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｐｒｏｖｅｓｔｈａｔｔｈｅａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｉｓｆｏｒｍｅｄｂｙｂｏｔｈＬａｎｄＴｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓ．
ａｎｄｔｈｒｅｓｈｏｌｄｐｏｔｅｎｔｉａｌ３．Ｔ—ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｈａｎｎｅｌｓｐｌａｙｔｈｅｒｏｌｅｉｎｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｍｂｒａｎｅ
ａｎｄｃｌｏｓｅｌｙｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｅｐｅａｔｅｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ
翌三垩堕奎兰堡主兰垡堡塞
ｔｈｅｙｔａｋｅｔｈｅｐｉｖｏｔａｌｐａｒｔｉｎｔｈｅｓｔａｒｔｉｎｇｏｆｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅ．４．Ｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｓｏｆａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｉｎｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙｔｈｅｒｅｐｅａｔｅｄ
ｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒ
ｏｎｅ，ａｒｃ
ｉｎｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓ，ｆｕｒｔｈｅｒｌｙｃｏｎｆｍｌｄｎｇｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｐｒｅｓｕｍｐｔｉｏｎｔｈａｔｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｉｓｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｅｎｈａｎｃｅｄｅｘｃｉｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｓｏｐｒｏｖｉｄｉｎｇｓｔｒｏｎｇｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｍｙｏｇｅｎｉｃｔｈｅｏｒｙ．
５．ＴｈｅＴ－ｔｙｐｅＣａ２＋ｃｕｒｒｅｎｔｓｄｅｓｉｆｉｅｓａｒｅｃｏｎｓｐｉｃｕｏｕｓｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｎｏｒｍａｌｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｗａｒｄｃｕｒｒｅｎｔｓａｒｅｔｈｅｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｆｅａｔｕｒｅｏｆＴ—ｔｙｐｅＣａ”ｃｈａｎｎｅｌｋｉｎｅｔｉｃｓｉｎｕｎｓｔａｂｌｅｄｅｔｒｕｓｏｒｍｙｏｃｙｔｅｓ．６．ＩｔｉｓｔｈｅＴ—ｔｙｐｅＣ一＋ｃｈａｎｎｅｌｓｎｏｔＬ－ｔｙｐｅｔｈａｔｐｌａｙｔｈｅｋｅｙｒｏｌｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｗｈｉｃｈｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔｉｔｉｓｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｌｙｆｅａｓｉｂｌｅｔｏａｐｐｌｙｔｈｅＴ—ｔｙｐｅｃａ２＋ｃｈａｎｎｅＩｂｌｏｃｋｅｒｓｔｏｔｒｅａｔｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ．
ＫｅｙＷｏｒｄｓ：Ｕｒｉｎａｒｙｂｌａｄｄｅｒ；Ｄｅｔｒｕｓｏｒｃｅｌｌｓ；Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；
Ｕｒｏｄｙｎａｍｉｃｓ；Ａｅｔｉｏｌｏｇｙ；Ｗｈｏｌｅ—ｃｅｌｌＰａｔｃｈＣｌａｍｐ；ｃａ２＋ｉｎｆｌｕｘ；
Ｃａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｓ；ＣａｌｃｉｕｍｃｈａｎｎｅｌｂｌｏｃｋｉｎｇＡｇｅｎｔｓ；Ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ．
第三军医大学博士学位论文
Ｔ型Ｃａ２＋通道在逼尿肌兴奋产生及逼尿肌
不稳定发生机理中的作用研究
摘要
逼尿肌不稳定（Ｄｅｔｒｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）是最常见的一种膀胱功能障碍，病因多样，发病率高，治疗困难，常引起尿频、尿急、急迫性尿失禁等临床症状，严重者导致肾、输尿管积水和肾功能损害，给患者精神及经济上造成极大的负担。

ＤＩ发病机理尚不清楚，争论主要集中在ＤＩ发生是神经源性还是肌源性。

最近资料显示ＤＩ与逼尿肌自发兴奋能力增强有关，发生ＤＩ的最终环节是肌细胞的兴奋性增高，是一种肌源性兴奋性改变。

逼尿肌细胞是～种可兴奋细胞，其兴奋的产生受多种因素调控，但Ｃａ２＋在其中起着最关键的作用；逼尿肌细胞兴奋的前提是Ｃａ２＋内流入胞，导致膜电位发生改变，使电压依赖式离子通道激活，细胞去极化；同时，ｃａ２＋发挥第二信使作用，激活其它ｃａ２＋依赖式离子通道与受体，共同参与细胞动作电位的引发。

Ｃａ２＋通道是Ｃａ２＋入胞的主要途径，逼尿肌细胞膜上有高密度的Ｌ型Ｃａ２＋通道，据此临床上应用Ｌ型ｃａ”通道阻断剂治疗ＤＩ，虽取得了一定疗效，但并不能消除ＤＩ的发生。

Ｔ型Ｃａ２＋通道是一种低电压激活的ｃａ２＋通道，门控行为具有快速失活和缓慢关闭的动力学特性，可在细胞静息电位水平形成“窗口”电流，促进膜的去极化作用，在细胞兴奋启动阶段发挥重要作用；同时，Ｔ型Ｃａ２＋通道的三个亚型ｎ１Ｇ、ｄｌＨ和ＯｌＩ具有各自的“门控”特性，功能上互有差异。

业已证实Ｔ型ｃａ”通道对心肌起博细胞、神经元细胞的兴奋起着关键作用，某些兴奋性增加的病理状态的产生也与Ｔ型Ｃａ２＋电流密度增强有关。

目前ＤＩ逼尿肌细胞兴奋性变化是否与Ｔ型ｃａ２＋通道的结构与功能异常有关尚未见研究报道，有关Ｔ型Ｃａ２＋通道在正常逼尿肌兴奋产生中的作用仅在近年才有零星的报道。

（２００１年）发现逼尿肌细胞还存在Ｔ型ｃａ”跨膜电流，肌条实验（２００３年）表明阻断Ｔ型Ｃａ２＋通道后逼尿肌兴奋性明显下降。

为此，我们从下面几个方面进行了研究：第一，对常用的ＤＩ研究模型（膀胱出口梗阻模型，ＢＯＯｍｏｄｅｌ）进行尿动力学上的动态监测，评估模型的最佳选择时期，在此基础上采用ＲＴ－ＰＣＲ法分析ＤＩ逼尿肌组织中Ｔ型ｃａ”通道亚型的表达，了解Ｔ型ｃａ２＋通道是否可成为ＤＩ发生的原因；第二，采用急性分离逼尿肌细胞，应用膜片钳技
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术的电压钳记录模式，记录与分析ＤＩ逼尿肌细胞是否存在Ｔ型ｃａ２＋电流的异常变化，探讨ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型Ｃａ２＋电流的动力学特性及其对细胞兴奋性的影响；第三，采用急性分离逼尿肌细胞，应用膜片钳技术的电流钳记录模式，记录与分析Ｃａ２＋通道阻断剂（Ｌ与Ｔ型）对ＤＩ逼尿肌细胞动作电位的影响，探讨Ｔ型ｃａ２＋通道与ＤＩ逼尿肌兴奋性之间的关系，以及Ｔ型ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ的可行性，为临床应用新型Ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ提供理论指导。

主要结果和结论如下：
１．发现ＤＩ逼尿肌细胞与正常逼尿肌细胞均有Ｑ．Ｉ亚型表达，且表达量上两者无显著的差别；发现ＤＩ逼尿肌细胞出现了ａ１Ｇ亚型的表达，而正常逼尿肌上无此亚型表达。

推测ＤＩ逼尿肌中ａ１Ｇ亚型的异常表达可能与ＤＩ逼尿肌细胞电位变化及机制中发挥了重要作用。

２．发现Ｔ一型Ｃａ２＋通道与Ｌ型Ｃａ２＋通道共同参与了逼尿肌细胞动作电位的形成。

这一发现为认识逼尿肌细胞Ｃａ２＋通道参与的细胞动作电位形成提供了实验依据。

３．发现Ｔ型Ｃａ２＋通道在逼尿肌细胞起到了维持细胞膜电位、阈电位的作用，与动作电位的启动和重复发放密切相关。

这一发现提示；Ｔ型ｃａ２＋通道在逼尿肌细胞兴奋产生机制中起着关键性的作用。

４．发现ＤＩ逼尿肌细胞产生动作电位的能力特别是连续动作电位发放的能力明显强于对照的稳定逼尿肌细胞，进一步证实了ＤＩ发病是逼尿肌细胞本身兴奋能力增强的结果，为ＤＩ发生的肌源性学说提供了有力证据。

５．证实了逼尿肌存在着Ｔ型ｃａ”通道表达；发现ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型ｃａ”电流密度明显强于稳定的逼尿肌细胞，Ｔ型Ｃａ２＋内向电流增大是ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型Ｃａ２＋通道活动的基本特征。

６．发现Ｌ型Ｃａ２＋通道在ＤＩ发生机制中不起主导作用，Ｔ型Ｃａ”通道起着关键作用，提示应用Ｔ型Ｃａ２＋通道阻断剂治疗ＤＩ理论上可行。

关键词：膀胱；逼尿肌细胞；梗阻；逼尿肌不稳定｛尿动力学；病因学
全细胞膜片钳；钙内流；钙通道：钙通道阻断剂：动作电位
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Ｔ型Ｃａ２＋通道在逼尿肌兴奋产生及逼尿肌
不稳定发生机理中的作用研究
刖吾
逼尿肌是一种特殊的平滑肌，可产生自发性收缩，即逼尿肌细胞具有可兴奋性【１１。

与所有的可兴奋组织一样，逼尿肌组织存在着对刺激产生兴奋反应的能力，在体外实验中，逼尿肌组织无自发性收缩，但在受到适当强度的牵拉刺激后将出现具有节律的收缩反应；在体内实验中，当膀胱充盈至最大膀胱容量时，逼尿肌将出现意识无法抑制的收缩，表明逼尿肌是一种具有自发兴奋能力的组织１２］。

由于膀胱功能调节复杂，因此目前有关逼尿肌兴奋的产生和调节机制尚不清楚【３，４】。

逼尿肌不稳定（Ｄｅｔｔｕｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）是最常见的一种膀胱功能障碍，指储尿期发生人为意识不能抑制的逼尿肌收缩，膀胱压≥１５ｃｍＨ２０，常引起尿频、尿急、急迫性尿失禁等临床症状，严重者导致肾、输尿管积水和肾功能损害【５ｔ６】。

ＤＩ发病机理不清楚，目前研究主要集中在是否存在神经调节异常，结果众说纷纭，争论不休１５’”。

近年研究显示逼尿肌在一定前负荷下都可产生收缩，而ＤＩ逼尿肌在更小的前负荷下即发生收缩，在同等的前负荷下ＤＩ逼尿肌的收缩频率明显增加，表明ＤＩ的发生与逼尿肌自发兴奋能力增强有关吼同时，ＤＩ逼尿肌的这种自发性活动增加受神经毒索（如河豚毒素、阿托品等）的影响较少，提示自发性活动起源逼尿肌本身或单个的逼尿肌细胞【９，１０］；这些清楚地说明了发生ＤＩ的最终环节是肌细胞的兴奋性增高，是一种肌源性兴奋性改变，并不依赖于神经因素。

因此，对逼尿肌兴奋性及兴奋性调节变化的研究将是认识ＤＩ的最有效途径之一。

ｃａ２＋对逼尿肌细胞的兴奋产生与调节起着关键作用［１１，１。

体外实验表明，逼尿肌动作电位去极化依赖于细胞外ｃａ２＋的入胞，即ｃａ２＋内流，当逼尿肌细胞外ｃａ２＋浓度为零时，细胞即使接受电刺激也不能产生动作电位［１３１，但当细胞出现Ｃａ２＋内流异常时，异常的ｃａ２＋振荡将使细胞的兴奋性发生改变［１４，１５１，Ｃａ２＋内流增加可诱发细胞产生兴奋，这种状况在心肌钙超载研究中已得到证实Ⅱｑ，逼尿肌细胞是否存在ｃａ２＋内流异常增加而诱发ＤＩ有待证实。

国家自然科学基金项目资助（编号：３０３７１４２９）
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Ｃａ２＋内流（Ｃａ２＋ｉｎｆｌｕｘ）主要依赖于跨膜电压激活式Ｃａ２＋通道，这种通道包括高电压激活式ｃａ２＋通道（如Ｌ型Ｃａ２＋通道等）和低电压激活式ｃａ２＋通道（Ｔ型Ｃａ２＋通道）［ｔ７］ｏ逼尿肌细胞具有高密度的Ｌ型ｃａ２＋通道，是细胞动作电位去极化期Ｃａ２＋内流的主要途径，认为参与动作电位“超射”的形成，以及细胞内“Ｃａ２＋库”的补充ｕｓ３。

但ＦｒｙＣＨ．等的研究显示：在静息电位一６０ｍｖ时。

应用毒蕈碱受体激动剂可使细胞内ｃａ２＋增加，这种增加本不需逼尿肌细胞去极化，因为在这样低的膜电位下，Ｌ型Ｃａ“通道不能开放，提示可能有低电压激活的Ｃａ２＋通道存在［１９１。

此外，临床上基于Ｃａ２＋内流是逼尿肌细胞动作电位产生最重要的因素之一，应用ｃａ”通道阻断剂（均为Ｌ型）治疗ＤＩ已有数十年，但也仅在～定程度上缓解ｌ｜缶床症状，却不能完全消除ＤＩ［３，４，２０１，提示通过Ｌ型ｃａ２＋通道的Ｃａ２＋跨膜电流（即Ｌ型ｃａ２＋内向电流）在逼尿肌兴奋机制中并不占主导作用。

最近研究证实逼尿肌细胞膜上存在着Ｔ型Ｃａ２＋通道［１２ｌ。

Ｔ型ｃａ”通道是一种低电压激活式ｃａ２＋通道，有三种亚型，分别为ｏｌＧ、ｎ１Ｈ和ｏｌＩ，它们在在通道的激活与失活动力学、稳态特性、以及关闭动力学与复活等方面均存在明显差异，形成了Ｔ型ｃａ２＋通道门控行为的功能多样性特点【２１－２４１。

与Ｌ型Ｃａ２＋通道相比，Ｔ型ｃａ２＋通道具有以下特性‘２５１：①低膜电位激活；②快速失活和缓慢关闭动力学：③低单通道电导；④较强的Ｎｉ２＋选择性阻滞作用。

Ｔ型Ｃａ２＋通道特性使细胞在接近静息膜电位水平（一７０一．５０ｍｙ）的电压范围内形成一个“窗口”电流，促进膜的去极化作用，并激活相关的ｃａ２＋依赖式离子通道，引发动作电位的产生［２６１。

研究证实：心肌起搏细胞及神经细胞的兴奋启动都与Ｔ型Ｃａ２＋通道作用密切相关［２７，２８，２９］：Ｔ型Ｃａ２＋电流密度增强与某些兴奋性增加的病理状态产生有关（如高血压、心律失常、癫痫等）［３０。

３２】；细胞在表达Ｔ型Ｃａ２＋通道后，均有细胞功能活动加强的表现（如增殖、肌管融合等）［３３，３４］ｏ目前有关逼尿肌Ｔ型Ｃａ２＋通道的研究极少，仅见于ＦｒｙＣＨ圾其同事的报道【１２０５．－６１，认为Ｔ型Ｃａ２＋通道在正常逼尿肌兴奋性调控中起着重要作用。

Ｔ型ｃａ”通道与逼尿肌细胞兴奋产生的关系以及ＤＩ逼尿肌细胞兴奋性变化是否与Ｔ型ｃａ”通道的结构与功能异常有关尚未见相关研究，值得进一步深入。

本课题率先应用ＰＲ－ＰＣＲ法对正常与ＤＩ逼尿肌细胞的Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型表达情况进行了研究，并进一步采用分析离子通道特性的理想技术膜片钳探讨正常与ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型ｃａ２＋电流的动力学特性和功能，以期发现Ｔ型Ｃａ２＊通道在逼尿肌细胞兴奋产生机制及ＤＩ发生机理中的作用。

本项目是逼尿肌兴奋机制与ＤＩ发生机理研究的一个新的突破口，将有助于我们认知逼尿肌细胞兴奋的本质，为ＤＩ治疗提供理论指导。

本课题从下面几个方面进行研究：
第一部分：正常及ＤＩ逼尿肌Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型的表达研究。

第二部分：Ｔ型ｃａ２＋电流在正常逼尿肌细胞兴奋产生机制中的作用研究。

第三部分：正常与ＤＩ逼尿肌细胞Ｔ型Ｃａ２＋电流动力学特性及与兴奋性变化关系的研究。

第一部分正常及ＤＩ逼尿肌Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型的表达研究
本研究对常用的ＤＩ研究模型（膀胱出口梗阻模型，ＢＯＯｍｏｄｅｌ）进行尿动力学上的动态监测，评估模型的最佳选择时期，在此基础上采用ＲＴ－ＰＣＲ法分析正常与ＤＩ逼尿肌组织中Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型的表达，了解ＤＩ逼尿肌细胞的Ｔ型Ｃａ２＋通道是否出现离子通道结构状态的改变，Ｔ型Ｃａ２＋通道能否成为ＤＩ发生的原因。

材料与方法
一、材料
（一）实验动物：
实验动物采用标准雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，年龄３５～４０天，体重１３０～１５０９，购自第三军医大学动物中心。

㈢主要试剂与仪器：
１．主要试剂
（１）戊巴比妥钠
（２）ＤＥＰＣ
（３）Ｔｒｉｐｕｒｅ
（４）ＲＴ．ＰＣＲ逆转录试剂盒（５）ＴａｑＤＮＡ聚合酶
（６）ＡＭＶ反转录酶
（７）甘油
（８）琼脂糖（进口分装）（９）溴化乙锭
００）ＥＤＴＡ
２．要设备和仪器
（１）Ａｖｌ２７１微量灌注泵（２）Ｄａｎｔｅｃ尿动力学检测仪（３）５０１型恒温水浴槽（４）ＰＥ９６００ＰＣＲ扩增仪上海行知化工厂
华美公司
Ｒｏｃｈｅ公司，美国
Ｐｒｏｍｅｇａ公司，美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司，美国Ｓｉｇｍａ，美国
中山生物技术公司中山生物技术公司中山生物技术公司
３Ｍ公司，美国
美国
重庆实验设备厂
Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司，美国
（５）分光光度计
（６）光学数字分析天平
（７）紫外分光光度计
（８）ＴＧＬ一１６Ｇ高速离心机（９）ＴＣＬｌ２００低温超速离心机００）Ｒ２８电泳槽
ＯＤＰ：Ａｃ５００电泳仪
㈢主要液体的配制：
（１）ＩＭＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ＰＨ：７．５）Ｂｅｃｋｍａｎ公司，美国上海市天平仪器厂
Ｂｅｃｋｍａｎ公司，美国上海
日本
北京
Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司，美国
将６０．５５９Ｔｒｉｓ溶于４００ｍｌ水中，并加３６．５％ＨＣｌ３７．５ｍｌ，将溶液体积调整为５００ｍｌ调节ｐＨ至７。

５，分装成小份，进行高压灭菌备用。

（２）０．５ＭＥＤＴＡ
加１８６．１９乙二胺四乙酸二钠盐至８００ｍｌ水中，加热至８０。

Ｃ，用ＮａＯＨ调整ＰＨ至８．０，将体积调至１０００ｍｌ，分装成小份，进行高压灭菌。

（３）溴化乙锭（１．０ｍｇ／ｍ１）
加１９溴化乙锭至１００ｍｌ水中，用磁力搅拌器搅拌半小时以保证充分溶解，然后将其转入另一棕色瓶中，并储存于４。

Ｃ。

（４）ＴＢＥ电泳缓冲液（５Ｘ）
５４９＂Ｉｒｉｓ碱
２７．５９硼酸
２０ｍｍｏＦＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）加双蒸水１０００ｍｌ充分溶解，混匀，用时稀释１０倍
（５）ＤＥＰＣ处理水
ＤＥＰＣｌｍｌ加双蒸水调至１０００ｍｌ，分装成小份，进行高压灭菌。

二、方法
㈠ＤＩ研究模型的制作与建立：
１．动物选择：
实验动物采用标准雌性Ｗｉｓｔａｒ大鼠，年龄３５～４０天，体重１３０～１５０９，购自第三军医大学动物中心。

２．模型制作：
第三军医大学博士学位论文
采用膀胱出口梗阻（ＢＯＯ）法建立模型［３７，３８】。

２．１分组：根据充盈期膀胱压力测定及随机法将最终纳入实验研究的大鼠分为：假手术组即对照组１０只，梗阻组３０只。

２．２方法：膀胱颈部结扎法形成不完全性膀胱出口梗阻
２．３手术步骤：
２．３．１梗阻组：
①０．３％戊巴比托钠按３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内注射麻醉。

②腹部及会阴部２％碘伏消毒，取下腹正中切口，长ｌｃｍ，于腹直肌旁钝性分离，打开腹腔，显露膀胱。

⑧自尿道外口插入外径ｌｍｍ软质硬膜外麻醉管入膀胱，眼科镊将膀胱并导管轻轻提起，尖镊钝性分离膀胱颈部，颈部因血循环丰富呈鲜红色，易与膀胱体部区别。

④膀胱颈游离后用１号丝线结扎，注意勿穿破尿道，松紧度以线结刚靠近导管为宜。

⑤经导管向膀胱内注入生理盐水０．３～０．４ｍｌ，膀胱膨胀后退出导管，１６号注射针头于膀胱顶部穿破，迅速插入一长１５ｃｍ软质硬膜外麻醉管进行膀胱造瘘（见照片卜１），造瘘管膀胱内保留０．３～Ｏ．５ｍｍ，可吸收线紧密结扎造瘘口并用脂肪组织覆盖，
⑥用４号丝线固定造瘘管于腹壁肌肉，然后在腹、背、颈部皮下打一隧道将造瘘管引出，外露部分保留约２～３ｃｍ，７号丝线固定。

⑦全层缝合腹膜及腹壁肌肉，１号丝线缝合皮肤，造瘘管敞口以防膀胱压力上升导致尿外渗。

⑧术后第二天用火灸法将造瘘管封闭后埋藏于皮下，７号丝线在腹、背、颈部各缝合一针固定以防滑动。

２．３．２假手术组（对照组）：
对照组采用同样的麻醉，同样的外科手术方法，游离膀胱一尿道交界处，但不结扎，然后关闭腹腔。

２．４术后处理：
２．４．１动物集中喂养，每笼５～６只，保持动物笼清洁干燥。

２．４．２所有实验动物术后均给予青霉素２万单位腹腔内注射一次，饮水中加盐酸土霉素（４００ｍｇ／１，国产）三天。

３．尿动力学检测：
３．１麻醉：勿需麻醉，清醒状态下进行膀胱功能测定。

３．２操作：
３．２．１在术后ｌ、３、５、６、８周进行。

３．２．２将大鼠置于一限制笼中，于颈部导管埋藏处切一小口，将导管挑出，剪去封闭端。

３．２．３插入一１号注射针头，经三通装置连接微量灌注泵与尿动力学检查仪，轻压腹部，排净尿液。

３．２．４膀胱灌注液采用３７℃生理盐水，灌注速度为：对照组０．０２～Ｏ．ｉｍｌ／ｍｉｒｌ，手术组０．０５～２ｍｌ／ｍｉｎ。

３．２．５一次捡测周期大约为５ｍｉｎ，从灌注开始到排尿时停止。

３．２．６检测参数：
①腔内压：由尿动力学检查仪记录：
②残余尿：通过造瘘管直接测量；
③膀胱容量（排尿量＋残余尿）；
④排尿百分比（排尿量／膀胱容量Ｘ１００）
⑤排尿阈压（逼尿肌开始收缩时的压力一灌注开始时的压力）；
⑥排尿压（排尿最大压一排尿阈压）；
⑦膀胱顺应性；
⑥膀胱自发收缩活动（逼尿肌收缩所产生的压力波动数／ｍｉｎ）。

３．２．７每只大鼠检测三次，取均值。

３．２．８检测完毕后用火灸法将导管末端封闭，埋藏于皮下并固定以便下次检测，缝合切口，整个过程太鼠始终处于清醒状态。

３．３膀胱顺应性的计算方法【３９】：
膀胱顺应性（Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ，ｃ）为逼尿肌压力增加与膀胱容量增加的比值。

根据ＩＣＳ的定义可以用下式表示：
Ｃ＝ｄＶ／彳Ｐ
式中表示顺应性，，ｄＰ表示压力增加值，ＡＶ表示压力增加了彳Ｐ时的膀胱容量增加值。

３．４逼尿肌兴奋性测定：
逼尿肌兴奋性异常主要包括逼尿肌不稳定（Ｄｅｔｍｓｏｒｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＤＩ）和逼尿肌无反射（Ｄｅｔｒｕｓｏｒａｒｅｆｌｅｘｉａ，ＤＡ）。

主要根据ＩＣＳ的定义，逼尿肌不稳定是指逼尿肌在储尿期内膀胱出现逼尿肌收缩。

在膀胱充盈期测压过程中可见的逼尿肌收缩所至的压力波动，
但压力上升幅度并非一定要达到或大于１５ｃｍＨ２０，而只要呈期相性（即有压力上升支和下降支）压力波，ＤＩ即可成立。

４．统计学处理
以上所有相关的实验数据均应用ＳＰＳＳ统计学软件处理，结果以均值±标准差表示（；±ｓ），组间以｝检验或方差分析进行处理，Ｐ＜０．０５为相差显著，Ｐ＜０．０１为相差非常显著。

㈢正常与ＤＩ逼尿肌Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型的表达：
采用逆转录聚合酶链式反应（Ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ—ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ－ＰＣＲ）方法对正常和ＤＩ模型逼尿肌细胞中３种Ｔ型Ｃａ２＋通道亚型ｏ１Ｇ、
８１Ｈ和ｏｌＩ进行检测‘３４，４０］。

１．组织选择：
ＤＩ模型第５、６周大鼠及同期假手术组无ＤＩ发生的大鼠新鲜膀胱逼尿肌组织。

２．方法：
２．１总ＲＮＡ的提取：
提取步骤：整个操作于冰浴中进行，所有使用器械均经ＤＥＰＣ水处理，并戴口罩、
手套操作，以防酶降解ＲＮＡ。

①猛击大鼠头部致昏，断颈放血，剪开下腹部，全切膀胱。

取膀胱体部组织（平
输尿管膀胱开口处以上离断膀胱）块约ｌＯＯｍｇ，即刻置入盛有４。

ＣＤＥＰＣ处理水的平
皿中，解剖镜下仔细剔除粘膜及膀胱外膜，将逼尿肌组织剪碎，移入玻璃匀浆器，自
然沉淀，吸去上清液。

②加入１．０ｍＬＴｒｉｐｕｒｅ分离液，匀浆组织，再移入１．５ｍｌ的ＥＰ管中，弹匀，室温孵育５ｍｉｎ，使组织变性完全。

③每管样品（１ｍＬ）加入Ｏ．２ｍＬ氯仿／异戊醇（２４：１），振荡充分混匀，室温孵
育１０ｍｉｎ。

④４℃离心１２０００９Ｘ１５ｒａｉｎ，分为上（无色液相含总ＲＮＡ）、中（白色乳状含蛋白质）和下（红色含ＤＮＡ）三相。

⑤将上层液相移入另一经ＤＥＰＣ水处理的ＥＰ管中，加入０．ＳｎｌＬ异丙醇（１：１），
颠倒数次混匀，置－２０。

Ｃ２０ｍｉｎ，沉淀ＲＮＡ。

⑥４℃离心１２０００９Ｘ１５ｍｉｎ，弃上清，管底可见少许白色沉淀（ＲＮＡ）
⑦每管加７５％乙醇ｌｍＬ，剧烈振荡，洗涤ＲＮＡ沉淀，４℃离心７５００９Ｘ１０ｒａｉｎ，
弃上清ｘ２次。