药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物抗乙酰胆碱酯酶活性研究

药用植物内生真菌的分离及其次生代谢产物抗乙酰胆碱酯酶活
性研究
杨中铎;周静怡;杨明俊
【摘要】目的:从4种植物的内生真菌中筛选对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性的提取物.方法:用组织块法分离4种植物中的内生真菌；对分离出的纯内生菌用液体培养基发酵培养,用等体积乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取发酵液并用乙醇对菌丝体进行索氏提取,得到各组分提取物；用改良的Ellman法测定提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性.结果:共分离出53株内生真菌,其中有7种内生真菌萃取物有不同程度的抑制乙酰胆碱酯酶活性,其中以XX -10的正丁醇组份的抑酶活性最强.结论:药用植物中存在丰富的内生真菌,其代谢产物具有一定的抗乙酰胆碱酯酶活性,可作为筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的新资源.
【期刊名称】《中医药学报》
【年(卷),期】2011(039)004
【总页数】3页(P69-71)
【关键词】内生真菌;分离;次级代谢产物;乙酰胆碱酯酶抑制剂
【作者】杨中铎;周静怡;杨明俊
【作者单位】兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050;兰州理工大学生命科学与工程学院,甘肃兰州730050
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
阿尔茨海默病(Alzheimer＇s disease，简称 AD)是老年痴呆中最常见疾病，属中
枢神经系统渐进发展的致死性神经原发性退行病变。

随着世界人口老龄化进程的加快，AD将成为继心脑血管疾病、癌症和艾滋病之后又一严重威胁人类健康和生存质量的“世纪病”［1］。

对于该病的治疗，目前最有效的手段是乙酰胆碱酯酶抑制剂的使用［2，3］。

20世纪90年代后期，在合成来源和植物来源的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂开发
的同时，日本的科技工作者开始筛选微生物来源的AChE抑制剂，Izawa等首先报道从淡紫灰链霉菌中分离的AChE抑制剂cyclophostin［4］，Omura 等报道了从青霉和曲霉中分离的一组化合物arisugacins和territrems对AChE有抑制作
用［5］，这些研究结果都证明从微生物中寻找AChE抑制剂是一条可行且环保高效的方法。

内生真菌(Endophytic fungi)具有丰富的生物多样性，不仅能够参与植物次生代谢产物的合成以及对植物次生代谢产物进行转化，还能独立产生丰富的次生代谢产物，是天然产物的重要来源，是具有高度开发价值的新型生物资源。

近十年来植物内生菌及其活性代谢产物已成为微生物学研究的一大热点［6－8］。

为了得到具有乙
酰胆碱酯酶抑制活性的次级代谢产物，本文对4种植物一品红(Euphorbia pulcherrima)、半夏(Pinellia ternate)、细辛(Manchurian Wildginger)、狼毒(Stellera chamaejasme Linn)的内生真菌进行分离，并检测其代谢产物对乙酰胆
碱酯酶的抑制作用，旨在为开发治疗老年痴呆的新药奠定基础。

1 材料
1.1 实验材料 2009年10月从甘肃临洮采集生长在野外的健康无病虫害的一品红(Euphorbia pulcherrima)、半夏 (Pinellia ternate)、细辛 (Manchurian
Wildginger)、狼毒(Stellera chamaejasme Linn)植株备用。

以上植物由兰州理工大学生命科学与工程学院杨林副教授鉴定。

1.2 培养基分离培养基:PDA培养基(马铃薯培养基)+硫酸链霉素(200mg/L)，孟加拉红培养基+硫酸链霉素(200mg/L)。

纯化培养基:PDA培养基。

1.3 仪器上海博迅SPX－100B－Z生化培养箱、YXQ－SG46－280S型高压灭菌
锅(上海博迅实业有限公司)、SHZ－82型生化摇床(江苏省荣华仪器制造有限公司)、SW－CJ－2FD型超净台(苏州苏净安泰空气技术有限公司)、HH－2数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)、RE－5286A型旋转蒸发仪(上海亚荣生
化仪器厂)、Biotek Elx 808型酶标仪。

1.4 药品与试剂乙酰胆碱酯酶(AchE，EC 3.1.1.7，sigma公司)、石杉碱甲(huperzine A，Sigma公司)、0.1 M 的 pH=8.0和 pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液(PBS)、5，5＇－二硫代双(2 －硝基苯甲酸)(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB，sigma公司)、碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide，ATCI，sigma 公司)、其余所用试剂均为分析纯。

2 方法
2.1 待测样品的制备
2.1.1 内生真菌的分离和纯化
取四种植物的球茎、茎、叶及花，用无菌水冲洗干净。

用解剖刀将球茎切成
0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块，将茎切成1cm的小段，叶片和花切成
0.5cm×0.5cm的小片。

在无菌条件下将切好的材料置于75%乙醇消毒3min后再用0.1%升汞溶液处理。

球茎2min、茎1.5min、叶和花各1min。

无菌水冲洗3次，切去边缘，接入含硫酸链霉素(200U/mL)的分离培养基上，每个平板放置4块，然后置28℃培养箱中倒置培养3～7d。

取切口处新长出的菌丝，及时转接至
新鲜的PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落形态、颜色的差异以及长出
时间的不同，分别挑取各菌落边缘菌丝转接于分离培养基平板上进行再培养。

培养数日后，观察记录菌落的形态。

对获得的菌株进行纯化培养，经菌株编号后，转至PDA斜面培养基上，于28℃培养箱中培养5～7d，然后放入4℃冰箱中保存。

表面消毒最后1次冲洗后的无菌水，取少量涂布于含链霉素(200U/mL)的分离培养
基上，28℃恒温培养，观察是否有真菌长出。

2.1.2 次生代谢物提取液的制备
将菌株活化后，用接种环挑取适量菌丝接种于PDB液体培养基(500mL的三角瓶
装液量为125mL)。

28℃、160r/min培养4～7d后，将培养成熟的液体培养基用布氏漏斗抽滤。

滤液分别加入等体积的乙酸乙酯和水饱和正丁醇进行萃取;固体菌
丝干燥后用索氏提取器醇提6～8h，分别收集发酵液和菌丝提取液的有机相，减
压回收即得乙酸乙酯组分、水饱和正丁醇组分和醇提组分。

用pH=8.0的磷酸盐
缓冲液(PBS)溶解配制成10mg/mL，备用。

2.2 活性筛选
采用改进的Ellman方法［9］在96孔酶标板上测定样品的乙酰胆碱酯酶抑制活性。

具体操作如下:在96孔酶标板中依次加入140μL PBS(0.1M pH=8.0)，20μL 样品溶液(10mg/mL)，15μL AChE(0.28U/mL，pH=8.0 PBS溶解稀释)。

4℃孵育
20min后，加10μL DTNB(0.075mol/L)及 10μL ATCI(0.01mol/L)。

37℃孵育
20min后，用酶标仪在405nm下测定其吸光度值。

根据下式计算抑制率:抑制率(%)=［(空白组－完全抑制组)－(样品－样品本底)］
/(空白组－完全抑制组)×100%，其中，空白组用20μL PBS(pH 8.0)代替20μL样品溶液;完全抑制组用20μL石杉碱甲(0.125mg/mL)代替20μL样品溶液。

样品本底组用15μL PBS(pH=8.0)代替 15μL AChE(0.28U/mL，pH=8.0 PBS溶解稀释)。

所用样品平行做3次，取其平均值，石杉碱甲为阳性对照。

3 结果与讨论
从一品红植物组织中共分离到14株内生真菌，从半夏植物组织中共分离到14株内生真菌，从细辛植物组织中共分离到13株内生真菌，从狼毒植物组织中分离到12株内生真菌。

通过Ellman比色法对所有样品的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行了测定，其中有7种内生真菌萃取物有不同程度的抑制乙酰胆碱酯酶活性，其中以XX－10的乙酸乙酯组份的抑酶活性较强，结果见表1。

表17 种内生真菌萃取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性(±s)
从表1可以看出，在浓度是10mg/mL时，这7种内生真菌萃取物显示了较强的乙酰胆碱酯酶抑制率，尤其是XX－10的正丁醇组份。

这说明，内生真菌是发现乙酰胆碱酯酶抑制剂的一个新的重要来源，能为开发治疗阿尔茨海默病的新药提供有用的先导化合物。

上述具有乙酰胆碱酯酶抑制作用提取物的活性成分正在分离中。

参考文献:
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60(5):446－452.
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［5］Omura S，Kuno F，Otoguro K，et al.Arisugacin，a novel and selective inhibitor of acetylcholinesterase from Penicilliumsp.FO －4259
［J］.J antibiot(Tokyo)，1995，48(7):745.
［6］Strobel G A.Endophytes as sources of bioactive products
［J］.Microbes and Infection，2003，5(5):535 －544.
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［9］Orhan I，Sener B，Choudhary MI，et al.Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory acitivity of some Turkish medicinal plants ［J］.J Ethnopharmacol，2004，9(1):57 －60.。