ELISA试验基本步骤及材料和试剂

ELISA 【2 】根本步骤和重要试剂.材料
留意：本步骤为间接ELISA步骤
一重要步骤
1 包被
取所要包被的物资,提前设计好所需浓度,依据包被孔数盘算所需包被物的量,用包被液稀释至所需体积,分加至各孔中.
包被前提：两种选择：一是将ELISA板直接置4℃留宿;也可以先置37℃孵育2小时再转入4℃留宿.
2 洗涤
包被停止后弃失落包被液,用PBST进行洗涤,办法为PBST加满每孔,静置5-10min,弃失落洗液,从新加满,反复洗涤3-5次,最后拍干ELISA板等待下一步关闭.
3 关闭
常用10%小牛血清,取第2步的ELISA板加关闭液至每孔,体积至少为所加包被液的两倍.关闭前提也有两种选择：直接置于4℃留宿,或者置于37℃温育2-4h,具体何种前提不同物资的ELISA可能不同.
4 洗涤
关闭停止的ELISA板进行洗涤,办法同步骤2.最后拍干等待参加一抗.
5 参加一抗
一抗即为你要检测的物资,一般加之前须要稀释,具体稀释倍数不同试验不同须要本身探索.一抗样品一般用包被液稀释,稀释到所需浓度后参加到响应孔中.反响前提为37℃孵育2h.
6 洗涤
具体同步骤4.
7 加响应HRP-标记的商品化二抗
加响应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物资则对应加抗鼠二抗）,一般也用关闭液稀释,稀释倍数参考二抗解释书.将稀释好的二抗参加各孔,37℃反响1-1.5h.
8 洗涤
具体同步骤4.
9 显色
常用OPD作为显色底物,但OPD致癌,也有效TMB作为底物,,这里只介绍前者.显色须要设置装备摆设显色液,具体办法为：在步骤8进行到一半使设置装备摆设显色液,为10ml底物缓冲液加0.015g OPD粉末（现实操作因为OPD有毒不便利称量故只需稍微参加一点即可）,等待OPD完整消融.待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液参加之前设置装备摆设的10ml溶液中混匀,连忙将此显色液分加至ELISA各孔中.然后将ELISA板置于37℃反响约10min.
10 终止
将ELISA板掏出,每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反响,连忙到酶标仪上读数（OPD为底物是读数波长为490nm,TMB为底物时波长为450nm）.
二材料.试剂
1 ELISA板
专用于EILSA的产品称为ELISA板,国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式,须要购置.常用聚苯乙烯和聚氯乙烯材料.留意：聚苯乙烯材料今朝只有进口,特色是孔大,加满约300ul,此时试验中所加各试剂（包被液.一抗.二抗.显色液.终止液等）均为
100ul体积.而聚氯乙烯多为国产,孔较小,加满约200ul,此时各试剂只需加50ul体积即可.
2 各试剂配制
1）包被液（PH6.3的碳酸盐缓冲液）
无水Na2CO3 0.1696g
NaHCO3 0.2856g
SW 100ml
完整消融至4℃,一周内应用
2）PBST配方
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.24g
TW-20 0.5ml
SW 1000ml
3)底物缓冲液
Na2HPO4 3.682g
柠檬酸 1.02g
DW 200ml
不需灭菌,4℃保存
4）3% H2O2
30%H2O2 100ml
SW 900ml
5）显色剂
底物缓冲剂 10ml
3%H2O2 150ul
OPD 15mg
个中H2O2 最后加
6）终止液
浓硫酸：SW = 1:8
浓硫酸迟缓参加到SW 中,并搅拌散热
三留意事项
1 包被
所谓37℃反响,一般取一个37℃的水浴锅,在水面放一较大泡沫板,将ELISA板置于泡沫板上即可,其余步骤的37℃反响操作同此;
全部ELISA进程中所有须要较长时光等待的步骤（包被.关闭.加一抗孵育.加二抗孵育）均须要将ELISA包起来再放入冰箱或水浴锅中,一般可直接用一次性EP手套套起来即可.
2 洗涤
最常规的洗涤步骤是洗涤3次,每次距离5min,具体试验可能会微调,洗涤次数可以3-6次不等,距离5-10min不等;
每次洗涤后要将ELISA板尽可能拍干后在进行下一步操作,尤其是每个洗涤步骤的最后一次洗涤要尽可能拍干,拍干可在纱布.吸水纸长进行,也可以购置洗板机.
3 显色
配制显色液时3%过氧化氢必定要最后参加,参加混匀后连忙分装到ELISA板中,即在加过氧化氢前要完整完成洗涤的操作;
OPD一般在倒数第二次洗涤前参加,要留有约10min时光以确保OPD完整消融. 其他未尽事宜可查阅相干材料.。