河川沙塘鳢DMRT1基因的克隆及其表达分析

别的基础是遗传基因。随着分子生物学技术的 不断发展［４］，鱼类性别决定相关基因如 ＤＭＹ基 因［５］、芳香化酶基因［６］、Ｓｏｘ基因家族［７］和 ＤＭＲＴ 基因家族［１５－２０］等都被广泛研究报道。
ＤＭＲＴ （ｄｏｕｂｌｅｓｅｘ ａｎｄ ｍａｂ３ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）基 因 家 族 的 成 员 与 性 别 决 定 和分化相关，其中 ＤＭＲＴ１基因在演化过程中具 有高度的保守性［８］。ＤＭＲＴ１基因位于级联反应
关键词：河川沙塘鳢；ＤＭＲＴ１基因；ｑＲＴＰＣＲ；基因克隆；表达分析 中图分类号：Ｓ９１７．４ 文献标识码：Ａ
鱼类的性别决定机制具有多样性、易变性和 原始性等特点［１］，可分为单性（ｕｎｉｓｅｘｕａｌｉｔｙ）、雌雄 同 体 （ｈｅｒｍａｐｈｒｏｄｉｔｉｓｍ ） 和 雌 雄 异 体 （ｇｏｎｏｃｈｏｒｉｓｍ）［２］。绝大多数鱼类为雌雄异体，少 数鱼类 雌 雄 同 体［３］。 硬 骨 鱼 的 性 别 决 定 一 般 取 决于遗传和环境两大因素，而且这种作用具有可 塑性［３］。多种环境因素如外源激素、温度、ｐＨ、水 质以及盐度等都可能影响性别决定，但是决定性
文章编号：１００４－２４９０（２０１８）０５－０５６９－１２
河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１基因的克隆及其表达分析
张红燕１，朱文旭１，赵 诚１，张宏叶１， 王 涛１，陈树桥２，尹绍武１，贾永义２
（１．南京师范大学生命科学学院，海洋科学与工程学院，南京 ２１００２３；２．浙江省淡水水产研究所， 农业部淡水渔业健康养殖重点实验室，浙江省淡水水产遗传期：２０１７－１２－０７ 基金项目：浙江省淡水水产研究所农业部淡水渔业健康养殖重点实验室开放课题（重大）（ＺＪＫ２０１８０３）；江苏省高 校自然科学研究面上项目（１８ＫＪＢ２４０００１）；中央财政农业技术推广资金项目（ＴＧ１５－００３）；江苏省科技 支撑计划（农业）项 目 （ＢＥ２０１３４４１）；南 京 市 科 技 计 划 项 目 （２０１５０５０５９）；常 州 市 科 技 发 展 计 划 项 目 （ＣＥ２０１６２００５） 作者简介：张红燕 （１９９５－），女，江 苏 南 京 人，硕 士 研 究 生，主 要 从 事 鱼 类 种 质 资 源 与 遗 传 育 种 研 究。Ｅｍａｉｌ： ９７８９２３３４９＠ｑｑ．ｃｏｍ 通信作者：尹绍武，教授，Ｅｍａｉｌ：ｙｉｎｓｈａｏｗｕ＠１６３．ｃｏｍ；贾永义，副研究员，Ｅｍａｉｌ：１３８６７２８３８７６＠１６３．ｃｏｍ
３．南京市水产科学研究所，南京 ２１００３６）
摘 要：以河川 沙 塘 鳢 （Ｏｄｏｎｔｏｂｕｔｉｓｐｏｔａｍｏｐｈｉｌａ）为 研 究 对 象，采 用 ｃＤＮＡ末 端 快 速 扩 增 （ＲＡＣＥ）技 术 对 ＤＭＲＴ１的全长基因进行了克隆，并利用生物信息学技术分析其结构和功能；采用实时荧光定量 ＰＣＲ（ｑＲＴ ＰＣＲ）技术检测了河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１基因在 ８种组织（鳃、肠、心、肌肉、脑、肝、脾、性腺）、胚胎发育的 ８个时 期（受精卵期、桑椹胚期、原肠胚期、神经胚期、体节期、口裂期、出膜后 １ｄ和出膜后 ３ｄ）以及性腺发育的 ４个 时期（Ⅰ ～Ⅳ期）中的表达变化。结果表明，河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１基因 ｃＤＮＡ序列的全长为 ２０２５ｂｐ，编码 ２９７ 个氨基酸，其中包括 ８９４ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），７３ｂｐ的 ５′非编码区和 １０５８ｂｐ的 ３′非编码区。与已知物种 的氨基酸序列比对后发现，河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１的氨基酸序列与军曹鱼（Ｒａｃｈｙｃｅｎｔｒｏｎｃａｎａｄｕｍ）、欧洲鲈鱼 （Ｄｉｃｅｎｔｒａｒｃｈｕｓｌａｂｒａｘ）的同源性最高。ＤＭＲＴ１基因在河川沙塘鳢的精巢组织大量表达，而在卵巢、肌肉、心以 及肝 ４种组织中表达较少，在其它组织中几乎不表达；ＤＭＲＴ１基因在胚胎发育的各个时期都有表达，在原肠 期的表达量最高；此外，ＤＭＲＴ１基因表达量在精巢发育的不同时期呈先下降后上升的趋势，在精子成熟期（Ⅳ 期）达到最大值，而在卵巢发育的不同时期表达量较少且表达强度差异不明显，因而推测河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１ 基因与精巢的发生和功能的维持有关。研究结果为解析河川沙塘鳢 ＤＭＲＴ１基因的功能及其性别决定机制 提供了基础资料，也为开展河川沙塘鳢单性育种奠定了基础。
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海 洋 渔 业
２０１８年
的上游，作 为 转 录 调 控 因 子，对 雄 性 性 腺 的 形 成 和功能的维持、多种组织和器官的分化和形成具 有重要 意 义［９］。在 无 脊 椎 动 物 果 蝇 （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）和线虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）的性 别决定基因中发现了共有的 ＤＭ结构域［１０］；在脊 椎 动 物 的 两 栖 类 如 黑 斑 蛙 （Ｐｅｌｏｐｈｙｌａｘ ｎｉｇｒｏｍａｃｕｌａｔｕｓ）中 ＤＭＲＴ１基因在雄性 性 腺 中 特 异性表达［１１］；鸟类 ＤＭＲＴ１蛋白的表达量减少会 导致胚胎 中 雄 性 （ＺＺ）性 腺 的 雌 性 化 ［１２］；小 鼠 （Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）的 ＤＭＲＴ１基因调控精原细胞的 发育及分化［１３］；人类若发生 ＤＭＲＴ１基因的片段 缺失会阻碍精巢的发育［１４］。ＤＭＲＴ１基因在鱼类 中广泛存在，目 前 在斑 马鱼 （Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ）［１５］、青 *（Ｏｒｙｚｉａｓｌａｔｉｐｅｓ）［１６］、尼 罗 罗 非 鱼 （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ ｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）［７］、奥 里 亚 罗 非 鱼 （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｃｏ ａｕｒｅｕｓ）［２］、非洲胡子鲶（Ｃｌａｒｉａｓｇａｒｉｅｐｉｎｕｓ）［１７］、乌 鳢 （Ｃｈａｎｎａ ａｒｇｕ）［１８］、西 伯 利 亚 鲟 （Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ ｂａｅｒｉｉ）［１９］等 鱼 类 中 已 进 行 过 广 泛 的 报 道 研 究， ＤＭＲＴ１可作为斑马鱼幼苗时期性别决定的指示 基因［１５］，能 够 调 节 青 * 精 原 细 胞 的 分 化［１６］。 此 外，该基因被认为是尼罗罗非鱼精巢分化的分子 标记［７］，由此可见，ＤＭＲＴ１基因参与了脊椎和无 脊椎动物的性别决定和分化过程［２０］。