细粒棘球绦虫感染犬及egm9蛋白免疫犬引起免疫应答及研究

细粒棘球绦虫感染犬及EgM9蛋白免疫犬引起的免疫应答研究
摘要
目前，国内外对宿主抗细粒棘球绦虫免疫的研究主要集中在宿主体内的免疫保护、免疫逃避与免疫损伤机制。

有很多关于细粒棘球绦虫病的中间宿主的免疫抗原Eg95的研究报道，但对终末宿主犬的免疫保护抗原还在研究当中。

本研究通过免疫组织化学方法与分子生物学方法，探索宿主感染细粒棘球绦虫和EgM9蛋白免疫后，机体外周免疫系统、肠道的粘膜免疫系统产生免疫应答的情况，以期为临床研制相关疫苗提供实验依据。

本研究首先经pET-41b重组质粒转化的大肠埃希菌（BL-21）对EgM9蛋白进行诱导表达，通过SDS-PAGE对表达产物进行分析，证明所表达的确实为EgM9蛋白，再对其进行纯化，得到符合免疫抗原要求的EgM9重组目的蛋白。

将实验犬分为四组（Ⅰ组：EgM9蛋白免疫组；Ⅱ组：EgM9蛋白免疫后感染原头蚴组；Ⅲ组：直接感染原头蚴组；Ⅳ组：空白对照组），用纯化后的EgM9蛋白对Ⅰ组和Ⅱ组进行免疫试验，再分别对Ⅱ组和Ⅲ组人工感染原头蚴。

将实验犬剖检后进行荷虫数计算，结果表明用EgM9蛋白免疫犬后，可以使犬取得一定的免疫保护效果。

采集实验犬的肠系膜淋巴结和小肠，依据免疫酶组织化学和免疫荧光组织化学原理，运用直接法和抗原~抗体~抗体标记物法对其进行检测。

直接法结果表明Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组犬的肠系膜淋巴结和小肠上存在IgG抗体，反应都呈阳性；抗原~抗体~抗体标记物法结果表明Ⅰ组、Ⅱ组表现阳性，而Ⅲ组呈阴性，荧光显微镜下有明显的荧光位点，说明该方法可以对免疫犬的肠系膜淋巴结和小肠上的IgG进行定位检测。

通过Real-Time PCR对上述实验犬的肠系膜淋巴结和小肠组织中的三种细胞因子（IL-4、TGF-β和INF-γ）检测，表明I组和Ⅲ组实验犬的肠系膜淋巴结和小肠中IL-4与INF-γ均有明显变化，IL-4的数值远高于INF-γ，而在II组中，IL-4的数值虽然也高于INF-γ，但IL-4与INF-γ的数值同时也高于其他两组。

结果表明不论对犬进行免疫还是感染，都能引起Th1型和Th2型反应，但以Th2型反应为主。

关键词：细粒棘球绦虫；EgM9蛋白；犬；免疫组织化学；抗体反应
I
Research in immune response of Echinococcus granulosus infected and EgM9 protein immunized dogs
Abstract
Currently, the study on the host anti Echinococcus granulosus immunity in home and abroad is mainly concentrated on the host endosomotic immunoprotection, immune evasion and immunologic injury mechanism. There are many study reports on the immune antigen Eg95 of the intermediate host of the Echinococcus granulosus disease, while the study on the immunoprotection antigen of the final host dog is still in progress. This study is through the immunohistochemical method and molecular biological method to research the immune response condition produced in the body periphery immune system and enteric tunica mucosa immune system after the host being infected with Echinococcus granulosus and EgM9 protein immune, in the hope of providing experiment base for researching and developing and preparing relevant clinic vaccine.
This study is firstly to make the induced expression to the EgM9 protein through the Escherichia coli (BL-21) which is converted from pET-41b recombinant plasmid, then to analyzes the expression products through SDS-PAGE to prove what is expressed is EgM9 protein in deed, and then to carry out purification to it to obtain the EgM9 recombinant target protein which meets the immune antigen requirements.
The experiment dogs are divided into four groups (Group I: EgM9 protein immune group; Group II: group being infected with protoscolex after EgM9 protein immune; Group III: group being directly inflected with protoscolex; Group IV: blank contrast group), to carry out immunity test to the Group I and Group II with purified EgM9 protein, then to do artificial protoscolex infection to the Group II and Group III respectively. After dissecting the experiment dogs and doing inspection, the load worm number calculation is carried out; the result indicates that after immunizing the dogs with EgM9 protein the dogs can obtain some certain immunoprotection effect.
To collect mesenteric lymph nodes and small intestines of the experiment dogs, based on principles of the immune enzyme histochemistry and immunofluorescence histochemistry, it is to utilize direct method and antigen-antibody-antibody marker method to carry out inspection. The result of the direct method indicates the mesenteric lymph nodes and small intestines of the Group I, Group II and Group III dogs exist IgG antibody, all of the reactions show positive; the result of the antigen-antibody-antibody marker method indicates the Group I and Group II show positive while the Group III shows negative, under the fluorescence microscope there are apparent fluorescence loca, which indicates this method can make localization inspection to the IgG in the mesenteric lymph nodes and small intestines of the immune dogs.
Through Real-Time PCR inspection to the three kinds of cell factors (IL-4, TGF-β and INF-γ) in the mesenteric lymph node and small intestine tissues of the above experiment dogs, it indicates both the IL-4 and the INF-γ in the mesenteric lymph nodes and small intestines of the Group I and Group III experiment dogs have apparent change, the number of IL-4 is much high above the INF-γ, while in the Group II, although the number of IL-4 is also higher than that of the INF-γ, the numbers of the IL-4 and INF-γ are also higher than that of the other groups at the same time. The results indicate no matter it is to carry out immunization or carry out infection to dogs, they both can cause Th1 type and Th2 type reactions, but they are with Th2 type reaction as main.
Keywords:Echinococcus granulosus; EgM9 protein; dog; immunohistochemistry; antibody response
符号及缩写表
英文缩写及全称 中文名称 Acetone丙酮Acrylamide 聚丙稀酰胺Ag (Antigen) 抗原Agarose 琼脂糖
Amp (Ampicillin)
APES(3-Ethoxycarbonyl Three Aminopropyl Silane)氨苄青霉素
3-氨丙基三乙氧硅烷
BSA(Bovine Serum Albumin) 牛血清白蛋白Citric Acid 柠檬酸
Coomassie Brilliant Blue R-250 DAB(3,3’- Diaminobenzidine)考马斯亮蓝R-250 3,3’-二氨基联苯胺
DEPC(Diethyl Pyrocarbonate) 焦碳酸二乙酯dNTP(Deoxy-ribonucleoside Triphosphate) 寡聚核苷酸EDTA(Sodium Ethylene Diamine Tetracetate)乙二胺四乙酸钠FITC(Fluorescein Isothiocyanate) 异硫氰酸荧光素g(Gram) 克
h(Hour)
HRP(Horseradish Peroxid) 小时
辣根过氧化物酶
IgG(Immunoglobumin G) 免疫球蛋白G Imidazole 依咪哒唑
IPTG 异丙基-β-D-半乳糖苷Kanamycin 卡那霉素
L(Liter) 升
Lysozyme 溶菌酶
M(Mol) 摩尔
mL(Microliter) 毫升
min(Minutes)
mm(Millimeter) 分钟毫米
Paraffin 石蜡
PCR(Poly-Merase Chain Reaction)聚合酶链式反应PBS(Phosphate buffered Solution)磷酸盐缓冲液
pH
Polyformaldehyde 酸碱度多聚甲醛
TEMED 四甲基乙二胺Tris 三羧甲基氨基甲烷Tryptone 胰蛋白胨
μg(Microgram) μL(Microliter) Xylene 微克微升二甲苯
Yeast Extract 酵母提取物
V
独 创 性 声 明
本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：时间：年月日
关于学位论文使用授权的说明
本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论文被查阅和借阅。

本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名：时间：年月日
导师签名：时间：年月日
新疆农业大学硕士学位论文
第一部分 概述
第一章 细粒棘球蚴病的研究进展
棘球蚴病（Echinococciosis）是由带科、棘球属的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)幼虫寄生于牛、羊及人等多种哺乳动物的肝、肺及其他内脏器官所致的一种人畜共患的慢性寄生虫病，俗称包虫病（Hydatid disease）。

我国是棘球蚴病发病率最高的国家之一，至今已在25个省、市、自治区的人、畜间发现原发性棘球蚴病[1-3]。

目前，分类学已确认的棘球绦虫有4种，即细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis，Em)、少节棘球绦虫(Echinococcus oligarthtus)和福氏棘球绦虫(Echinococcus vogeli)。

在我国主要流行由细粒棘球绦虫的幼虫引起的囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis)和多房棘球绦虫的幼虫引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis)，以前者为主[4]。

对个别地区调查表明，绵羊和牦牛感染率分别为
27%~81%和30.8%~49.4%，犬感染率为29.5%~62.5%，牧民和牧区从事畜牧兽医工作的人员感染率较高，该病堪称牧区第一大寄虫病。

世界卫生组织（WHO）已将其列为法定报告动物疫病，我国农业部将其列入三类动物疾病，卫生部将其列为丙类人间传染病[5]。

几十年来，国内外在棘球蚴病的防治上已取得不少成功经验。

新西兰等发达国家已经成功消灭了包虫病，阿根廷等中等发达国家也已控制了包虫病的流行。

目前，有很多关于细粒棘球绦虫病的中间宿主的免疫抗原Eg95的研究报道[6-10]，但对于终末宿主犬的免疫保护抗原还在研究当中[7，9，11]。

Eg95疫苗虽然对绵羊包虫病的保护率达95%，由于牧区绵羊数量巨大，初次免疫羔羊需注射2针，以后每年还要加强免疫1次，如此多的免疫次数，很难实现高密度和高频度免疫，同时，绵羊数量远远多于犬的数量，尤其像新疆、内蒙古、青海等高发区犬与绵羊的数量比往往在1:40左右，甚至更高，而且Eg95疫苗不能解决终末宿主排卵污染环境的危害，更不能解决人被感染的问题。

犬作为棘球蚴病的主要传染源，患病犬将虫卵及孕节排到外界，在适宜环境下传播到各处，从而增加绵羊、牛、人等易感对象的感染机会。

近年来随着宠物热的兴起，各地养犬数量猛增，加上牲畜的多渠道流通和群众防治知识的缺乏，导致棘球蚴病发病率呈现上升趋势。

因此，控制包虫病的流行必须从切断该病的流行环节上入手，加强对犬的管理，防止棘球
1
细粒棘球绦虫感染犬及EgM9蛋白免疫犬引起的免疫应答研究
蚴病在人、家畜间发生和蔓延。

1.1 细粒棘球绦虫生活史及流行病学
1.1.1 细粒棘球绦虫的生活史及结构
细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，Eg)必须依赖两种哺乳动物即终末宿主（definitive host）(犬等)和中间宿主（intermediate host）（绵羊等）才能完成生活史[12]。

细粒棘球绦虫是绦虫类较细小的一种，主要寄生在犬的小肠内，亦寄生于狼、狐等其他犬科动物。

细粒棘球绦虫的虫体长2～6mm，由一个头节和三个体节（即幼节、成节和孕节）组成。

棘球蚴呈圆形囊状体，由囊壁和囊内含物组成；囊壁由外向内分为角皮层和胚层，胚层向囊内长出原头蚴和生发囊，生发囊仅有一层生发层，向内长出原头蚴或进一步发育为子囊，甚至孙囊。

囊内充满液体，称为棘球蚴液或囊液，具有抗原性。

孕节内含有感染性的虫卵，孕节或虫卵污染的水或食物被中间宿主如羊、牛等家畜及人食入后，即在胃或十二指肠内孵化，六钩蚴脱壳而出，先附着于小肠粘膜，再钻入肠壁血管，随血液经门静脉到达肝脏，故以肝包虫病最为多见。

1.1.2 细粒棘球绦虫的流行病学
细粒棘球绦虫存在广泛的宿主适应性，其终末宿主和中间宿主动物之间长期形成了比较固定的动物间循环关系。

细粒棘球绦虫中间宿主达50多种，包括人[13，14]，在我国有10种有蹄家畜均有不同程度的感染：绵羊、山羊、牦牛、黄羊、水牛、骆驼、马、驴、骡以及猪，其中绵羊受感染的程度最为严重，终末宿主仅限于犬、狼、豺等犬科动物[15]。

我国棘球蚴病为典型的家养动物循环型，即病原循环于家畜和家、牧犬之间[16]。

人、畜间发病率和犬的感染率大体为正相关系，其中绵羊是包虫病的最适宜宿主，因此将人、绵羊包虫病及犬的成虫感染率视为判定包虫病流行严重与否的重要依据。

虽然我国病原循环类型为典型的家养动物循环型，但由于对野生动物的保护越来越受到重视，野生动物种群数量不断扩大，其与家养动物之间的接触频率也就不断增加，所以在辽阔的高发区内，不排除野生循环类型的存在。

人的发病率往往受社会因素的影响，在不同的人群和地区有显著差异，以不同职业和城乡之间差异最为明显[17]。

我国包虫病流行因素有许多，但主要有以下几点：病畜内脏喂狗或乱弃；虫卵对环境的严重污染；人与家畜和环境的密切接触。

此外，区域性流行是我国包虫病另一重要流行特点，在我国大面积的流行区域内发病率有明显的高低差别，高发病区相连成片，以养羊业为主的畜牧业地带为高发区[18，19]，形成我国广大畜牧业地区一种特有的地方
新疆农业大学硕士学位论文
病，包括新疆、西藏、青海、宁夏以及甘肃五省区及近邻地带，并由此向东蔓延，波及十几个省区的散发[16，20]，形成一般流行区。

根据调查，细粒棘球蚴绵羊和牦牛感染率分别为27%~81%和30.8%~49.4%，犬感染率为29.5%~62.5%。

多房棘球蚴牦牛感染率8.6%，绵羊为7.7%，狐狸为55.8%，犬感染率为11.5%~21.4%，人感染率为7.7%~9.03%[5]。

1.2 细粒棘球绦虫分子生物学研究
在不同的地理环境和宿主中，细粒棘球绦虫存在着实质性的基因遗传差异，运用分子生物学手段，从基因水平上进行细粒棘球绦虫不同发育阶段的研究，对疫苗、诊断试剂及抗寄生虫药物的研制和开发具有重要意义[21] 。

1.2.1 细粒棘球绦虫cDNA文库的研究
传统的cDNA文库是用Trizoi法从囊液中原头节和囊壁提取总的RNA，以寡聚dT为引物从mRNA的3’polyA尾巴逆转录合成cDNA后，用pSPORT载体制备，其特征是易被DNA、线粒体的转录产物和宿主基因组等污染，在从3’polyA逆转录合成cDNA时，不能保证合成全长的cDNA，因此有大量不完整的cDNA。

上述提取的总RNA用碱性磷酸酶处理，使基因组DNA、核糖体和线粒体的RNA去磷酸化，再用叶酸焦磷酸酶切除mRNA 帽子结构，然后用Gene Racer Linker寡核苷酸连接，反转录后以Not I引物和Linker特异性引物进行PCR扩增，再克隆入pSPORT载体，制备加帽寡核苷酸文库，这是保证了反转录模板来源于核內mRNA。

剪接前导cDNA文库只是在PCR扩増时用NotⅠ引物和剪接前导特异性引物，其他与加帽的寡核苷酸文库制备相同。

加帽寡核苷酸cDNA文库和剪接前导cDNA文库均能减少线粒体及核糖体RNA或基因组的污染，从而提高Eg cDNA文库的质量[22]。

Zhang等[23]从细粒棘球绦虫原头节cDNA表达库中，首先分离出蠕虫层粘连蛋白的cDNA克隆(egmo3)。

由于克隆cDNA序列与67kDa层粘连蛋白受体序列同源而得以鉴定。

层粘连蛋白是哺乳动物非整联蛋白转移相关分子，从cDNA推测氨基酸序列含有268个氨基酸残基，分子量为29.9kDa。

Southern斑点分析提示细粒棘球绦虫基因组中可能有许多拷贝。

Northern斑点显示该基因只有一个转录产物，约lkb与cDNA插入片段大小相一致。

egmo3编码的多肽还与核糖体蛋白类的氨基酸广逆同源，而后者参与蛋白的合成。

因此，egmo3蛋白可能在细粒棘球绦虫有多种功能，不仅作为层粘连蛋白结合分子，而且在细胞分裂和生长中发挥作用。

1.2.2 细粒棘球绦虫抗原分子生物学研究
3
细粒棘球绦虫感染犬及EgM9蛋白免疫犬引起的免疫应答研究
常规使用的棘球绦虫抗原来源多样，取自虫体的各种粗抗原混有宿主血清成份或其它寄生虫交叉抗原而影响诊断效果。

除寻找基因诊断方法外，发现有诊断价值的基因工程重组抗原或特异性抗原肽也颇受重视。

1.2.2.1 AgB
AgB是细粒棘球蚴囊液中的一种分子量120kDa~160kDa耐热脂蛋白。

Rigano等[24]把囊液经SDS-PAGE后分成12、16、20或24 kDa3个亚基。

Barbieri等[25]从Eg囊液中分离出与AgB有关的蛋白条带是12、16和23kDa。

Gonzalez等[26]在AgB的低聚体中发现了两个不同的8kDa单体。

利用单克隆抗体研究AgB的8kDa单体，发现有6个表位簇拥在N-末端，1个在C-末端。

AgB8/1和AgB8/2是AgB的两个不同8kDa的最小亚基。

AgB8/1为7.5kDa，从细粒棘球绦虫幼虫的cDNA文库获得AgB8/1基因为331bp，有243bp开放阅读框，含有92bp内含子，与AgB的12kDa亚单位C-末端的核苷酸序列有94.3%同源性。

从细粒棘球绦虫的原头节cDNA文库获得的AgB8/2基因为393bp 片段，有270bp开放阅读框，有68bp内含子。

2个内含子位于N-末端的疏水序列和分泌肽之间，二者外显子核苷酸有53.5%的一致性，在内含子有50%的一致性。

Rott[27]用高效液相色谱法( HPLC)分析发现8、16、24kDa亚单位的氨基酸顺序非常相似。

陈新华等[28]利用大肠埃希菌分泌系统表达分泌型r-AgB的ScFv系能进行正确的折叠，得到具有完整抗原结合能力的表达产物，但产量低。

LuLu等[29]将细粒棘球蚴AgB基因结构转入酵母表达载体pXES2/ NTB 的开放阅读框，重组体可在酵母中表达特异性蛋白质。

1.2.2.2 Ag5
Ag5是一种脂蛋白，分子质量单位为60kDa，不耐热，加热至70℃时抗原失活。

Ag5为异二聚体，由两个22kDa和38kDa亚基以二硫键相结合。

22kDa亚基含有一个高度保守的糖胺聚糖结合基元GAG，它能帮助在宿主定植。

38kDa亚基活性区是丝氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-半光氨酸结构，结构非常保守。

但是，38kDa亚基分子结构中的丝氨酸被苏氨酸代替，没有蛋白水解酶活性，也没有蛋白酶抑制剂活性。

Ag5可能是一个特异的生理性酶解产物，更可能像胰蛋白酶一样折叠执行新功能的蛋白质[30]。

Zhang 等[31]发现Ag5的38kDa分子在不同的中间宿主中存在着异质性，并可用单克隆抗体加以鉴别。

1.2.2.3 Eg95
Lightowlers等[32]用抗天然六钩蚴抗原的抗血清从羊Eg (新西兰株)六钩蚴cDNA文库中成功筛选得到Eg95基因，并表达出Eg95-GST融合蛋白。

获得的Eg95基因长715bp，编
新疆农业大学硕士学位论文
码153个氨基酸，分子量为16.5kDa。

Chow等[33]研究表明Eg95分子属于一个基因家族，序列分析表明该家族含有7个基因，其中一个为假基因，有4个Eg95相关基因在细粒棘球绦虫六钩蚴发育阶段表达同一个Eg95蛋白，另外2个在六钩蚴内不转录。

林仁勇等[34]将克隆的XJ-Eg95基因序列与GeneBank中发现的Eg95基因家族序列进行了多重比较，发现其同源性达到97 %，所有碱基差异均集中于内含子区域，克隆的XJ-Eg95基因为部分片段，缺少5’端及3’端编码翻译区，这说明XJ-Eg95基因也是Eg95基因家族成员之一。

林仁勇等[35]研究发现Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫生活史的3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)均有表达，将重组质粒pUCm-T/ Eg95测序，结果表明插入Eg95基因长度为402bp，与GeneBank中的新西兰株Eg95基因序列完全相同，株系之间无差异，表明Eg95基因是高度保守的，在Eg生长发育中是维持生命所必需的，其保守程度表明选择性压力保持了编码序列的保守性。

1.2.2.4 Eg14-3-3蛋白
Eg14-3-3蛋白是一组高度保守的多功能蛋白质，通过多肽-蛋白质之间的相互作用，在细胞信号传递、细胞分化及细胞自然死亡的过程中发挥重要作用。

Eg14-3-3蛋白有7个亚型，对Eg14-3-3蛋白基因进行分析发现其中两个亚型与牛裂体吸虫的Eg14-3-3蛋白中的两个内含子在大小、位置和特点上十分相似。

棘球蚴的Eg14-3-3蛋白在中绦期、六钩蚴和原头蚴三个阶段都有发现。

成虫的Eg14-3-3蛋白分布于虫体顶突上部及相邻的表皮生发层。

经虫体切片染色证实该蛋白是由顶突腺产生分泌的；免疫印迹结果表明其存在于成虫体壁和排泄物中。

国内学者对中国株Eg14-3-3研究发现其与国外株同源性达到100%，这表明其可成为终末宿主的疫苗抗原。

1.2.2.5 EgA31蛋白
EgA31蛋白是一种纤维蛋白，是由完整cDNA PstⅠ-Hind Ⅲ片断编码的，分子量大约66kDa，在成虫的微棘、皮下细胞和生发层中最为丰富，在原头蚴微棘、虫卵和石灰小体的外周部分布较少[36]。

对其进行序列分析表明它与蠕虫副肌球蛋白有较高同源性，并且在细粒棘球绦虫各个发育阶段都得到表达。

Fu等[37 ]用重组抗原的抗血清对原头蚴和成虫等不同发育阶段的虫体进行免疫组化分析，显示虫体的表皮和皮下肌层含有该蛋白，尤其当原头蚴顶突和吸盘外翻后滴度最高。

该研究表明EgA31蛋白可能与吸盘的吸附功能相关，是一个很有希望的疫苗候选分子。

1.2.2.6 EgM基因家族
5
细粒棘球绦虫感染犬及EgM9蛋白免疫犬引起的免疫应答研究
Zhang等[10]在2003年利用mRNA的差异显示技术（DDRT-PCR）检测细粒棘球绦虫成熟虫体与非成熟虫体蛋白基因表达差异，筛选出了成熟虫体的特异性基因片段，即EgM基因家族。

该家族包括EgM4、EgM9和EgM123，大小分别为641bp、628bp和657bp，该基因家族有很高的序列重复性，由24个氨基酸组成的重复序列，在EgM4、EgM9和EgM123中分别有6、4、5个，该重复序列形成的α螺旋散在排列使正负电荷交替分布，构成亲水性通道。

免疫学实验证实EgM4和EgM123可以被感染细粒棘球绦虫的犬的阳性血清识别，而且EgM4比EgM123更敏感。

Zhang等[10]同时构建该家族蛋白的表达载体，其表达产物与QuilA佐剂混合后免疫犬，三免后攻虫，45天后剖检。

结果显示免疫组与对照组比较保护率达97%~100%，其中EgM9效果最为显著，可以使虫体发育受阻，减卵率达到97.7%；EgM123次之，为96.5%；EgM4稍差，为88%，该实验证实EgM蛋白家族为终末宿主良好的保护性抗原分子，但目前尚未在基因库中发现与其相似的序列，对于其功能也不是十分清楚，但可以肯定的是EgM蛋白家族在虫卵成熟的调节或代谢方面有很重要的作用。

1.3细粒棘球蚴病的免疫预防
1.3.1细粒棘球蚴病的免疫抗原
1.3.1.1原头蚴和囊液
张文宝[38]等1999年用细粒棘球绦虫原头蚴匀浆可溶性抗原一次接种犬，孕节抑制率为74.1%，三次接种犬，孕节抑制率达100%，使犬产生较好的抗细粒棘球绦虫攻击感染的能力，并对体内虫体发育产生明显的抑制作用。

这一点在流行病学上具有重要的意义，因为抑制了虫卵的产生也就切断了病原的生活史。

经包虫囊液免疫的羊用细粒棘球绦虫卵攻击感染时，羊的包虫囊数明显减少，但感染率则与对照组相似[39]。

Heath[40]先给4只犬各皮下注射囊液5mL，攻击感染后剖检，免疫犬平均虫数856条，而4只对照犬为2054条，表明注射囊液具有一定的免疫预防效果。

再给6只犬用不育囊诱发免疫，攻击感染后剖检，3只犬无虫，其余3只重度感染，而19只对照犬仅5%无虫，25%轻度感染，70%重度感染。

1.3.1.2六钩蚴或虫卵
Osborne等[41]1982年的研究表明，六钩蚴抗原经二次免疫接种后可使绵羊获得抗细粒棘球绦虫虫卵攻击感染的坚强抵抗力，大多数免疫绵羊得到完全保护。

Heath[40]给绵羊经口感染细粒棘球绦虫卵10~10000枚，结果9个月后约有70%的羊能防止攻击感染，
若给小鼠注射虫卵抗原诱发免疫，亦可产生针对经腹腔感染细粒棘球蚴的攻击。

1.3.1.3 基因工程疫苗
Lightowlers等[32]首次研制成功抗细粒棘球绦虫虫卵感染的基因工程重组抗原疫苗，命名为Eg95。

用重组抗原加佐剂后接种绵羊，每次用量为50μg，间隔1个月免疫2次。

二免后2周，每只试验羊用1000枚虫卵经口攻击感染，可获得95%以上的免疫保护。

因此Eg95抗原制备的棘球蚴病基因工程疫苗是最具发展前途的疫苗。

林仁勇[35]等为了研究细粒棘球绦虫Eg95抗原基因在细粒棘球绦虫新疆株的不同发育阶段的表达及其基因序列的差异性，根据Eg95基因序列设计引物，用PCR方法分别从新疆株细粒棘球绦虫3个不同发育阶段(原头蚴、六钩蚴和成虫)所构建的cDNA文库中克隆获得了Eg95目的基因，将其克隆至克隆质粒pUCm-T载体、通过测序并进行序列分析，结果从3个不同发育阶段的新疆株细粒棘球绦虫cDNA文库中均克隆出Eg95基因，其基因片段长度为402bp。

BLAST结果表明，所克隆的新疆株Eg95基因与GenBank 中的Eg95基因序列一致，从而说明Eg95基因在新疆株细粒棘球绦虫不同发育阶段均有表达，其基因序列无差异，为不同发育阶段细粒棘球绦虫分子疫苗的研究提供了一定的参考。

丁剑冰等[42]应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得了Eg95抗原基因，并将其克隆至克隆质粒pUCm-T载体，利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段分别克隆至原核表达质粒pET28和真核表达质粒pcDNA3上，成功构建了pET28-Eg95和pcDNA3-Eg95原核和真核表达质粒，为我国Eg95基因疫苗的研制奠定基础。

1.3.1.4 核酸疫苗与多肽疫苗
20世纪90年代Wolff等[21]提出了DNA(核酸)疫苗，该疫苗是将编码有某种保护性抗原蛋白的裸露质粒DNA注射到体内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生针对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。

核酸疫苗由于安全有效、操作简单、价廉易得、便于贮存与运输、省时省力，是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第3代疫苗，具有广阔的应用前景。

多肽疫苗是按照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，通过化学合成技术制备的疫苗。

随着免疫学的发展，人们发现多肽抗原作为虫体的一部分可人工合成，是棘球蚴病疫苗未来发展的方向之一。

据Lightowlers[33]1996年报道，从人工合成的106个多肽中，通过抗体反应初步确定多肽含有羊囊虫重组疫苗45W的宿主
7。