SMP-QC0028微生物鉴定管理规程

SMP-QC0028微⽣物鉴定管理规程
⼀、⽬的：
规范菌种以及控制菌检查中疑似菌的鉴定程序，以减少菌种污染和⽣长特性的改变，确保实验室安全和实验结果可靠。

⼆、范围：
适⽤于实验室所⽤标准储备菌株和控制菌检查中疑似菌的鉴定。

三、职责：
品质部：确保使⽤的菌株是可靠的，准确鉴别样品中控制菌，保证实验结果可靠。

四、内容：
1、试验菌株:
⼤肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]
⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]
⽩⾊念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98001]
⿊曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]
铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]
沙门菌（Salmonella）[CMCC(B)50094]
2、菌种确认试验的主要内容：
2.1 菌种的纯度确认。

2.1.1 试验内容。

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同⼀平板上的单菌落的⼤⼩、形状、颜⾊、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数⽣长期的培养物⾰兰⽒染⾊反应应呈现⼀致性；细胞形状、⼤⼩、荚膜、芽孢等特征应相似。

2.1.2 菌种的特性确认。

⽣化试验：各种微⽣物具有各⾃的独特的酶系统，因⽽在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物⼜具有不同的⽣化特征。

根据此特征，利⽤⽣物化学⽅法来鉴定不同的微⽣物的试验即为微⽣物的⽣化试验。

2.1.3 菌种的确定⽅法。

⽤⽆菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。

培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单⼀纯菌落，进⾏⾰兰⽒染⾊、镜检，观察其染⾊特性及菌形。

再做⽣化试验或使⽤菌种鉴定系统进⼀步鉴定菌种。

3、⼤肠埃希菌的确认：
3.1菌落形态。

3.1.1 取⼤肠埃希菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基或胆盐乳糖中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

3.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。

①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫⿊⾊、浅紫⾊、蓝紫⾊或粉红⾊,菌落中⼼呈深紫⾊或⽆明显暗⾊中⼼，圆形，稍凸起，边缘整齐，表⾯光滑、湿润，常有⾦属光泽。

②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红⾊或微红⾊，菌落中⼼呈深桃红⾊，圆形，扁平，边缘整齐，表⾯光滑，湿润。

3.2⾰兰染⾊、镜检。

3.2.1 ⾰兰染⾊。

①以接种环沾取⽆菌⽔于洁净载玻⽚上，取菌落形态（3.1.2 ①、②）的培养物少许，制成均匀涂⽚，⾃然或微温，再通过⽕焰2～3次⼲燥使固定。

②滴加结晶紫染液，染⾊1min，⽔洗⼲净。

③滴加碘液，媒染1min，⽔洗，以滤纸吸⼲余⽔。

④滴加95％⼄醇，脱⾊20～30s，⾄流出液⽆⾊，⽔洗。

⑤滴加沙黄染液，复染1min，待⼲后，镜检。

3.2.2 染⾊结果应是：⾰兰阳性菌呈蓝紫⾊：⾰兰阴性菌呈红⾊。

3.2.3 镜检结果应是：两端钝圆的短⼩直杆菌，单个或成对，⾰兰阴性，⽆芽孢，多有鞭⽑，以周⾝鞭⽑运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。

3.3 ⽣化试验。

3.3.1 靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋⽩胨⽔培养基中，35℃培养24-48h，沿管壁缓慢加⼊吲哚试剂，轻轻摇动试管，于两者接触⾯出现红⾊为阳性，⽆⾊为阴性。

3.3.2 甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于葡萄糖蛋⽩胨⽔培养基中，培养2`4天后，于培养液中加⼊甲基红指⽰液2～3滴（约1ml培养液加指⽰液1滴），轻微摇动，⽴即观察，呈现红⾊为阳性，橘红⾊为弱阳性，黄⾊为阴性。

3.3.3 ⼄酰甲基甲醇⽣成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于葡萄糖蛋⽩胨⽔培养基中，35℃培养48±2h，于2ml培养液中加⼊6% α-萘酚⼄醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在 20min）内出现红⾊应判为阳性，⽆红⾊反应为阴性。

3.3.4 枸橼酸盐利⽤试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐培养基斜⾯上，35℃培养2-4天，培养基斜⾯有菌苔⽣成，培养基中的溴麝⾹草酚兰指⽰剂由淡绿⾊变为深蓝⾊时为阳性，培养基颜⾊⽆改变、⽆菌苔⽣长为阴性。

3.3.5 乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指⽰剂为酸性品红者为红⾊：指⽰剂为溴麝⾹草酚蓝者为黄⾊），产⽓（⼩倒管内有⽓泡，⽓泡⽆论⼤⼩都是产⽓）。

4、⾦黄⾊葡萄球菌的确认：
4.1 菌落形态。

4.1.1 取⾦黄⾊葡萄球菌新鲜培养物⾄营养⾁汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈均匀浑浊⽣长，繁殖较多时易产⽣沉淀，沉淀易被摇散。

4.1.2 取上述培养物划线接种于⽢露醇氯化钠琼脂平板和卵黄氯化钠琼脂平板上培养24～72h观察结果。

①⽢露醇氯化钠琼脂平板上菌落形态⾦黄⾊，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄⾊环,菌落直径0.7-1mm。

②卵黄氯化钠琼脂平板上菌落形态⾦黄⾊，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1-2mm。

4.2 ⾰兰染⾊、镜检。

4.2.1 ⾰兰染⾊（见⼤肠埃希菌检查法3.2.1）
4.2.2 镜检结果：为⾰兰阳性球菌，菌体呈球形或略呈椭圆形，菌体较⼩，菌体⼤⼩不⼀。

⽆芽孢，⼀般不产⽣荚膜。

排列呈
不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。

4.3 ⽣化试验。

4.3.1 ⾎浆凝固酶试验。

试管法：取⽆菌试管（10mm×100mm）3⽀，各加⼊⾎浆和0.9%⽆菌氯化钠溶液（1： 1）0.5ml，1⽀加⼊营养⾁汤培养液0.5ml作为阳性对照：1⽀加⼊⽆菌营养⾁汤0.5ml作为阴性对照。

两管同时置37℃⽔浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察⼀次，直⾄24h。

检查时，轻轻将试管倾斜（动作勿⼤），仔细观察。

①阳性对照管：⾎浆和⽆菌⽔混合液加⾦黄⾊葡萄球菌营养⾁汤培养物，在3h后开始观察直⾄24h。

结果：⾎浆凝固。

②阴性对照管：⾎浆和⽆菌⽔混合液加稀释液，在3h后开始观察直⾄24h。

结果：⾎浆流动⾃如。

5、枯草芽孢杆菌的确认：
5.1 菌落形态。

5.1.1 取枯草芽孢杆菌新鲜培养物⾄营养⾁汤培养基中，经35℃培养18～24h后，呈浑浊⽣长。

5.1.2 取上述培养物划线接种于营养琼脂平板上，培养24～27h观察结果：菌落为灰⾊、⼲燥、皱缩、⽆典型卷发状。

5.2 ⾰兰染⾊、镜检。

5.2.1 ⾰兰染⾊（见⼤肠埃希菌检查法3.2.1）。

5.2.2 镜检结果：⾰兰阳性芽孢杆菌芽孢为椭圆到柱状，位於菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨⼤。

6、⽩⾊念珠菌的确认：
6.1 菌落形态。

6.1.1 取⽩⾊念珠菌新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖⾁汤培养基中，经35℃培养24～48h后，呈浑浊⽣长。

6.1.2 取上述培养物划线接种于沙⽒葡萄糖琼脂培养基平板上，经30～35℃培养24～48h （必要时延长⾄72⼩时）。

观察结果：呈乳⽩⾊偶见淡黄⾊，表⾯光滑有浓酵母⽓味，培养时间稍久则菌落增⼤，颜⾊变深、质地变硬或有皱摺。

6.1.3 取上述（6.1.2）培养物接种⾄⽩⾊念珠菌显⾊培养基平板上，经30～35℃培养24～48h（必要时延长⾄72⼩时）。

观察结果：平板上为绿⾊或翠绿⾊的菌落⽣长。

6.2 ⾰兰染⾊、镜检及芽管试验
取上述（6.1.3）培养物接种⾄1%聚⼭梨酯80-⽟⽶琼脂培养基上，培养24～48h。

取培养物进⾏染⾊，镜检及芽管试验。

6.2.1 ⾰兰染⾊（见⼤肠埃希菌检查法3.2.1）
6.2.2 芽管试验：挑取1%聚⼭梨酯80-⽟⽶琼脂培养基上的培养物，接种于加有⼀滴⾎清的载玻⽚上，盖上盖玻⽚，置湿润的平⽫内，置 35～37℃培养1～3h，置显微镜下观察，可见到由孢⼦长出短⼩芽管。

6.2.3 镜检结果：⾰兰阳性芽孢杆菌芽孢为厚膜孢⼦、菌丝、芽管。

7、⿊曲霉菌的确认：
7.1 镜检：可见孢⼦，菌丝。

8、铜绿假单胞菌的确认：
8.1 取铜绿假单胞菌新鲜培养物⾄营养⾁汤培养基中，经 35℃培养18～24h后，液⾯可形成菌膜，细菌在深层发育不良，呈微浑浊或透明状，菌液上层为蓝绿⾊。

8.1.1 取上述培养物接种于溴化⼗六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养 18～24h 后，观察结果：呈扁平、⽆定形、周边扩散、表⾯湿润，灰⽩⾊，周围时有蓝绿⾊素扩散。

8.2 ⾰兰染⾊、镜检。

8.2.1 ⾰兰染⾊（见⼤肠埃希菌检查法3.2.1）。

8.2.2 镜检结果：铜绿假单胞菌为⾰兰阴性、⽆芽孢杆菌。

单个，成对或成短链排列。

8.3 氧化酶试验。

取洁净滤纸⽚置于平⽫内，⽤⽆菌玻璃棒取斜⾯培养物涂于滤纸⽚上，滴加新配制的1%⼆盐酸N,N-⼆甲基对苯⼆胺试液，在
30秒内若培养物呈粉红⾊并逐渐变为紫红⾊为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

若斜⾯培养物为⾮⾰兰阴性⽆芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单孢菌。

否则，应进⾏绿侬菌素试验。

8.4 绿侬菌素(Pyocyanin)试验。

取斜⾯培养物接种于PDP琼脂培养基斜⾯上，培养24⼩时，加三氯甲烷3~5ml⾄培养管中，搅碎培养基并充分振摇。

静置⽚刻，将三氯甲烷相移⾄另⼀试管中，加⼊1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置⽚刻，观察。

若盐酸溶液呈粉红⾊，为绿侬菌素试验阳性，否则为阴性。

同时⽤未接种的PDF琼脂培养基斜⾯同法做阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为⾰兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阳性，判断供试品检出铜绿假单胞菌。

上述疑似菌为⾰兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿侬菌素试验阴性，应继续进⾏适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。

9、沙门菌的确认：
9.1 取沙门菌新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨液体培养基中，经35℃培养18～24h后，呈均匀浑浊⽣长。

9.1.1 取上述培养物划线接种于⽊糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48⼩时。

观察结果：菌落为淡红⾊或⽆⾊、透明或半透明、中⼼有或⽆⿊⾊。

9.1.2 ⾰兰染⾊、镜检。

9.2 ⾰兰染⾊（见⼤肠埃希菌检查法3.2.1）
9.2.1 镜检结果：沙门⽒菌为⾰兰阴性杆菌，⽆芽孢，两端钝圆。

除个别菌外，都具有鞭⽑，能运动。

9.3⽣化试验。

9.3.1三糖铁琼脂培养基。

⽤接种针挑选疑似菌落于三糖铁琼脂培养基⾼层斜⾯上进⾏斜⾯和⾼层穿刺接种，培养18～24⼩时。

结果判断：①斜⾯红⾊、底层⿊⾊并显⽰黄⾊；
②斜⾯红⾊，底层为黄⾊；
③斜⾯黄⾊、底层黄⾊或⿊⾊。

9.3.2靛基质试验。

将TSI或TSA斜⾯培养物作⽣化试验。

9.3.2.1⽤接种环沾取少许培养物，接种到蛋⽩胨⽔培养基中，培养24h，沿管壁滴加2~4滴靛基质试液后，轻摇试管，液⾯醇层出现玫瑰红⾊为阳性。

沙门菌应为阴性反应。

9.3.3尿素酶试验。

⽤接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜⾯，培养24h，斜⾯变为红⾊为阳性反应。

沙门菌属为阴性反应。

9.3.4赖氨酸脱羧酶试验（阳性）
⽤接种环沾取少许培养物，接种于赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种⼀⽀不含赖氨酸脱羧酶培养基的同样培养基中作为对照，培养24h~48h，观察结果：
对照管黄⾊产酸，试验管呈紫⾊为阳性反应；
对照管黄⾊，试验管黄⾊为阴性反应；
沙门菌应为阳性反应。

9.3.5氰化钾试验。

将培养物先接种⾄⾁汤培养基中，培养18~24h，⽤接种环沾取1环培养液，接种⾄氰化钾培养基内，另取1环培养液接种⾄不含氰化钾的同种对照培养基内作对照管，接种后即以橡胶塞塞紧，培养24~48h，观察结果：
对照管内有菌⽣长（混浊），试验管内也有菌⽣长为阳性反应；
对照管有菌⽣长（混浊），⽽试验管⽆菌⽣长（清亮）为阴性反应。

沙门菌应为阴性反应。

9.3.6动⼒检查。

⽤接种环沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂培养基中，培养24h，观察结果：
有动⼒的细菌能在穿刺线以外的培养基内⽣长使培养基呈混浊现象；
⽆动⼒的细菌只能沿穿刺线⽣长，不扩散，培养基可见清晰透明状；
⽆动⼒表现的培养物，应在室温保留2~3天，再观察。

绝⼤多数沙门菌动⼒阳性。

10、控制菌检查中疑似菌的鉴定：
10.1⽬前我司各品种涉及到的控制菌是⼤肠埃希菌、⾦黄⾊葡萄球菌、铜绿假单胞菌和沙门菌。

10.2当各选择性培养基平板上检出疑似菌时，先将待检培养物进⾏分离纯化，挑取待检菌在适宜的固体培养基上（通常是营养琼脂培养基）连续划线分离纯化，进⾏纯培养获取⾜够量菌体。

再按上述标准菌株的鉴定程序进⾏初筛试验确定待检菌的基本微⽣物特征。

五、参考⽂献：
《中国药典》2015年版
药品⽣产质量管理规范（2010年修订）
六、相关⽂件：
N/A
七、相关记录：
N/A
⼋、变更记录及原因：。