多杀菌素补料发酵工艺的研究
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结果表明，酵母提取物有利于菌体的生长，在添 加酵母提取物的各组中，生物量及多杀菌素产量均 大于不添加酵母提取物的对照组（ 表 1） 。另与酵母 浸粉相比较，酵母浸膏更有利于发酵产量的增长。
酵母浸膏最适浓度的筛选结果见表 2。胞内代 谢产物的产量受生物量影响较大，生物量提高，后期
产素 相 应 提 高，由 表 2 可 知，在 酵 母 浸 膏 浓 度 为 0． 5% 时，生物量最大，此时多杀菌素发酵产量最高。 所以采用 0． 5% 的酵母浸膏。
多杀菌素，又名刺糖菌素，是土壤放线菌刺糖多 孢菌经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯 类化合物。可有效防治鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘 翅目及膜翅目等多种害虫［1 － 2］。多杀菌素及其衍生 物兼有生物农药的安全性和化学合成农药的速效 性，因其具有低毒、低残留、对人安全、对非靶标动物 和环境安全、自然分解快等优点，曾先后于 1999 年、 2008 年、2010 年三次获得美国“总统绿色化学品挑 战 奖 （ Presidential Green Chemistry Challenge Award） ”［3 － 4］。
2 结果与分析
2． 1 基础培养基优化 由于多 杀 菌 素 发 酵 属 于 部 分 生 长 偶 联 型 发
酵［10］，且主要 在 稳 定 期 合 成 多 杀 菌 素［11］，因 此，只 有生物量达到一定量之后，发酵后期多杀菌素产量 才能进一步提高。刺糖多孢菌 ASAGF73 在发酵过 程中生长缓慢、延滞期长。酵母提取物和玉米浆干 粉营养丰富，常作为速效有机氮源，适量添加酵母提 取物和玉米浆干粉有利于菌丝生长。因此在本实验 中以生物量为主要目标在不影响前期发酵产量的前 提下进行了酵母提取物及玉米浆干粉的筛选。 2． 1． 1 酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的 影响 发酵配方中分别添加质量分数为 0． 3% 的酵 母浸膏和酵母浸粉，对照为不添加酵母提取物。
表 3 玉米浆干粉浓度对生物量及多杀菌素产量的影响
浓度 / % 灭菌后
生物量 / %
48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 4 15． 0 ± 0． 5 20． 8 ± 0． 4 22． 3 ± 0． 5 25． 3 ± 0． 5 26． 8 ± 0． 4 103． 0 ± 7． 0
发酵培养基（ g / L） ： 葡萄糖 70． 0，棉籽粉 20． 0， NaCl 3． 0，K2 HPO4 ·3H2 O 0． 2，FeSO4 ·7H2 O 0． 05， CaCO3 1． 0。大豆油 3 mL / L，pH 7． 0。
上述培养基 12l ℃ 灭菌 30 min，葡萄糖单独 115 ℃ 灭菌 25 min。
生物工程
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 3 期
多杀菌素补料发酵工艺的研究
邹球龙，郭伟群，王 超，胡 翔，韩 伟，张晓琳
（ 国家粮食局科学研究院，北京 100037） 摘 要： 利用 30 L 及 50 L 发酵罐，通过控制 pH 和补料优化多杀菌素发酵工艺，提高多杀菌素的产 量。采用优化后的补料发酵工艺，多杀菌素的发酵产量可达 1 050 μg / mL，较对照 575 μg / mL 提高 82% 。为多杀菌素的工业化生产提供了依据。 关键词： 刺糖多孢菌； 多杀菌素； 补料发酵工艺 中图分类号： TQ 920． 6 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 03 － 0086 － 03
我国对多杀菌素的研究还处于试验阶段，尚无 工业化生产的相关报道。现阶段多杀菌素的研究热 点主要集中在全合成和分子改造上［5 － 6］。国内多杀 菌素发酵水平较低，需进一步选育高产菌株，提高发 酵工艺水平。本研究利用 30 L 及 50 L 发酵罐对经 过多次诱变选育获得的多杀菌素高产菌株进行培养 基配方改良和发酵工艺优化，研究补料发酵工艺，为 多杀菌素的工业化生产奠定基础。
（ 1） 糖、氮的测定： 总糖测定参照山东科学院 SGD － Ⅳ全自动还原糖测定仪仪器说明书； 葡萄糖 及氨态氮测定参照 Nova BioProfile 300 多参数分析 仪仪器使用说明书。
（ 2） 生物量的测定： PMV 法，发酵液 4 000 r / min 离心 15 min，计算沉淀固体占发酵液的质量百分比。
Abstract： The fermentation process was optimized by controlling pH and fed － batch with the 30 L and 50 L fermentation tanks in order to increase the production of spinosad． The yield of spinosad reached to 1 050 μg / mL by the optimized method，which increased 82% compared with the control group of 575 μg / mL． This research provides the basis for the industrial production of spinosad． Key words： saccharopolyspora spinosa； spinosad； fed － batch fermentation process
0． 7 14． 8 ± 0． 5 21． 7 ± 0． 6 21． 7 ± 0． 6 26． 9 ± 0． 5 29． 2 ± 0． 5 102． 0 ± 6． 0
1． 0 15． 3 ± 0． 4 21． 9 ± 0． 5 23． 7 ± 0． 5 28． 9 ± 0． 4 31． 8 ± 0． 5 103． 0 ± 8． 0
发酵罐培养基同摇瓶，培养基 121 ～ 124 ℃ 在位 灭菌 30 min。灭菌后 pH 在 6． 5 ～ 7． 0 之间。
培养条件： 接种量 10% ，培养温度 29 ℃ ，摇瓶 转速为 240 r / min，发酵罐通过搅拌将溶氧控制在 40% 以上。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 基础培养基优化 本实验利用摇瓶在原发 酵培养基的基础上添加 0． 3%～ 0． 7% 的酵母提取物 及 0． 4%～ 1． 6% 玉米浆干粉进行氮源优化。 1． 3． 2 补料发酵工艺优化 1． 3． 2． 1 pH 的优化 流加稀盐酸调节 pH，将 pH
表 1 不同酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的影响
生物量 / %
项目
灭菌后 48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 3% 15． 0 ± 0． 5 19． 7 ± 0． 4 22． 2 ± 0． 3 27． 0 ± 0． 4 27． 3 ± 0． 5 106． 0 ± 4． 0 酵母浸膏
（ 3） 多杀菌素发酵产量的测定［9］： 取发酵液 2 mL，加入无水甲醇 4 mL，充分振荡 30 min，转速4 000 r / min 离心 10 min，上清 14 000 r / min 离心 5 min，上 清液用 HPLC 测定多杀菌素的产量。色谱条件： waters 高效 液 相 色 谱 仪： C18 反 相 柱 （ 250 mm × 4． 0 mm） ； 流动相为甲醇∶ 乙腈∶ 水 = 45 ∶ 45 ∶ 10 （ v / v / v， 其中水含 0． 05% 乙酸铵） ； 流速 1． 0 mL / min； 检测 波长 244 nm； 进样量 10 μL； 柱温25 ℃ 。
2013 年“农业科技成果转化资金项目”（ 2013GB24490638） 作者简介： 邹球龙，1984 年出生，男，科研助理． 通讯作者： 张晓琳，1975 年出生，女，研究员．
数分析仪，美国 Nova 公司； Waters 515 /2487 型高效 液相色谱仪，美国 Waters 公司。 1． 2 菌种与培养基 1． 2． 1 菌种
Study on the fed － batch fermentation process of spinosad
ZOU Qiu － long，GUO Wei － qun，WANG Chao，HU Xiang，HAN Wei，ZHANG Xiao － lin （ Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）
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粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 3 期
生物工程
分别控制在 6． 5、7． 0、7． 5 和 8． 0。 1． 3． 2． 2 残糖水平优化 补料工艺中，将基础葡萄 糖添加量由 60 g / L 降至 30 g / L，将残糖控制在不同 水平，对照为原工艺。 1． 4 相关参数检测
定生物量及产量，结果如表 3 所示。摇瓶筛选结果
表明添加一定量的玉米浆干粉有利于菌丝生长。随
着玉米浆干粉浓度的不断增加，生物量及产量先呈
上升趋势，在浓度为 1． 0% 时都达到最高。但是速 效氮源也存在类似于葡萄糖的阻遏效应［12］，随着玉
米浆干粉 的 继 续 增 加，生 物 量 的 变 化 表 现 出 抑 制 作用。
对照 15． 3 ± 0． 5 20． 9 ± 0． 4 22． 3 ± 0． 6 25． 1 ± 0． 5 26． 3 ± 0． 5 104． 0 ± 7． 0
0． 3% 15． 7 ± 0． 4 18． 0 ± 0． 5 20． 2 ± 0． 5 25． 5 ± 0． 5 25． 8 ± 0． 4 91． 0 ± 5． 0 酵母浸粉
对照 15． 2 ± 0． 4 16． 1 ± 0． 4 17． 7 ± 0． 5 19． 6 ± 0． 4 21． 0 ± 0． 4 53． 0 ± 5． 0
0． 7 15． 2 ± 0． 4 21． 1 ± 0． 5 22． 0 ± 0． 4 25． 0 ± 0． 4 26． 1 ± 0． 4 89． 0 ± 4． 0
2． 1． 2 玉米浆干粉对生物量及多杀菌素产量的
影响 在固定 0． 5% 酵母浸膏的基础培养基中，添
加不同比例的玉米浆干粉。分别培养不同时间后测
刺糖多孢菌 ASAGF73，本实验室保存。 1． 2． 2 培养基［7 － 8］
斜面及平板培养基（ g / L） ： 葡萄糖 5． 0，牛肉膏 3． 0，酪蛋白胨 0． 25，琼脂 18． 0。pH 7． 2 。
种子培养基（ g / L） ： 葡萄糖 15． 0，可溶性淀粉 10． 0，豆饼粉 3． 0，棉籽蛋白 3． 0，大豆蛋白胨 25． 0， MgSO4 2． 0。pH 7． 2。
1 材料与方法
1． 1 仪器设备 15 L 发酵罐，德国 satorius 集团； 30 L 及 50 L 发
酵罐，镇江东方生物工程设备有限公司； SBM / SS － X 摇床，瑞士 Kuhner 公司； Nova BioProfile 300 多参
收稿日期： 2013 － 11 － 18 基金项目：“十二 五”国家科技支撑计划课题 （ 2011BAD03B02 － 2 ） ；
1． 3 15． 6 ± 0． 5 21． 3 ± 0． 4 23． 3 ± 0． 4 25． 7 ± 0． 4 29． 6 ± 0． 4 93． 0 ± 6． 0
1． 6 15． 4 ± 0． 4 21． 6 ± 0． 6 23． 0 ± 0． 4 24． 7 ± 0． 4 26． 1 ± 0． 4 102． 0 ± 5． 0
表 2 酵母浸膏浓度优化结果
浓度 / % 灭菌后
生物量 / %
48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 3 14． 9 ± 0． 4 20． 6 ± 0． 5 22． 1 ± 0． 4 25． 1 ± 0． 4 26． 2 ± 0． 3 101． 0 ± 5． 0
0． 5 15． 7 ± 0． 4 21． 2 ± 0． 4 21． 3 ± 0． 3 26． 8 ± 0． 4 29． 6 ± 0． 4 105． 0 ± 3． 0
酵母浸膏最适浓度的筛选结果见表 2。胞内代 谢产物的产量受生物量影响较大，生物量提高，后期
产素 相 应 提 高，由 表 2 可 知，在 酵 母 浸 膏 浓 度 为 0． 5% 时，生物量最大，此时多杀菌素发酵产量最高。 所以采用 0． 5% 的酵母浸膏。
多杀菌素，又名刺糖菌素，是土壤放线菌刺糖多 孢菌经有氧发酵产生的次级代谢产物，属大环内酯 类化合物。可有效防治鳞翅目、双翅目、缨翅目、鞘 翅目及膜翅目等多种害虫［1 － 2］。多杀菌素及其衍生 物兼有生物农药的安全性和化学合成农药的速效 性，因其具有低毒、低残留、对人安全、对非靶标动物 和环境安全、自然分解快等优点，曾先后于 1999 年、 2008 年、2010 年三次获得美国“总统绿色化学品挑 战 奖 （ Presidential Green Chemistry Challenge Award） ”［3 － 4］。
2 结果与分析
2． 1 基础培养基优化 由于多 杀 菌 素 发 酵 属 于 部 分 生 长 偶 联 型 发
酵［10］，且主要 在 稳 定 期 合 成 多 杀 菌 素［11］，因 此，只 有生物量达到一定量之后，发酵后期多杀菌素产量 才能进一步提高。刺糖多孢菌 ASAGF73 在发酵过 程中生长缓慢、延滞期长。酵母提取物和玉米浆干 粉营养丰富，常作为速效有机氮源，适量添加酵母提 取物和玉米浆干粉有利于菌丝生长。因此在本实验 中以生物量为主要目标在不影响前期发酵产量的前 提下进行了酵母提取物及玉米浆干粉的筛选。 2． 1． 1 酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的 影响 发酵配方中分别添加质量分数为 0． 3% 的酵 母浸膏和酵母浸粉，对照为不添加酵母提取物。
表 3 玉米浆干粉浓度对生物量及多杀菌素产量的影响
浓度 / % 灭菌后
生物量 / %
48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 4 15． 0 ± 0． 5 20． 8 ± 0． 4 22． 3 ± 0． 5 25． 3 ± 0． 5 26． 8 ± 0． 4 103． 0 ± 7． 0
发酵培养基（ g / L） ： 葡萄糖 70． 0，棉籽粉 20． 0， NaCl 3． 0，K2 HPO4 ·3H2 O 0． 2，FeSO4 ·7H2 O 0． 05， CaCO3 1． 0。大豆油 3 mL / L，pH 7． 0。
上述培养基 12l ℃ 灭菌 30 min，葡萄糖单独 115 ℃ 灭菌 25 min。
生物工程
粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 3 期
多杀菌素补料发酵工艺的研究
邹球龙，郭伟群，王 超，胡 翔，韩 伟，张晓琳
（ 国家粮食局科学研究院，北京 100037） 摘 要： 利用 30 L 及 50 L 发酵罐，通过控制 pH 和补料优化多杀菌素发酵工艺，提高多杀菌素的产 量。采用优化后的补料发酵工艺，多杀菌素的发酵产量可达 1 050 μg / mL，较对照 575 μg / mL 提高 82% 。为多杀菌素的工业化生产提供了依据。 关键词： 刺糖多孢菌； 多杀菌素； 补料发酵工艺 中图分类号： TQ 920． 6 文献标识码： A 文章编号： 1007 － 7561（ 2014） 03 － 0086 － 03
我国对多杀菌素的研究还处于试验阶段，尚无 工业化生产的相关报道。现阶段多杀菌素的研究热 点主要集中在全合成和分子改造上［5 － 6］。国内多杀 菌素发酵水平较低，需进一步选育高产菌株，提高发 酵工艺水平。本研究利用 30 L 及 50 L 发酵罐对经 过多次诱变选育获得的多杀菌素高产菌株进行培养 基配方改良和发酵工艺优化，研究补料发酵工艺，为 多杀菌素的工业化生产奠定基础。
（ 1） 糖、氮的测定： 总糖测定参照山东科学院 SGD － Ⅳ全自动还原糖测定仪仪器说明书； 葡萄糖 及氨态氮测定参照 Nova BioProfile 300 多参数分析 仪仪器使用说明书。
（ 2） 生物量的测定： PMV 法，发酵液 4 000 r / min 离心 15 min，计算沉淀固体占发酵液的质量百分比。
Abstract： The fermentation process was optimized by controlling pH and fed － batch with the 30 L and 50 L fermentation tanks in order to increase the production of spinosad． The yield of spinosad reached to 1 050 μg / mL by the optimized method，which increased 82% compared with the control group of 575 μg / mL． This research provides the basis for the industrial production of spinosad． Key words： saccharopolyspora spinosa； spinosad； fed － batch fermentation process
0． 7 14． 8 ± 0． 5 21． 7 ± 0． 6 21． 7 ± 0． 6 26． 9 ± 0． 5 29． 2 ± 0． 5 102． 0 ± 6． 0
1． 0 15． 3 ± 0． 4 21． 9 ± 0． 5 23． 7 ± 0． 5 28． 9 ± 0． 4 31． 8 ± 0． 5 103． 0 ± 8． 0
发酵罐培养基同摇瓶，培养基 121 ～ 124 ℃ 在位 灭菌 30 min。灭菌后 pH 在 6． 5 ～ 7． 0 之间。
培养条件： 接种量 10% ，培养温度 29 ℃ ，摇瓶 转速为 240 r / min，发酵罐通过搅拌将溶氧控制在 40% 以上。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 基础培养基优化 本实验利用摇瓶在原发 酵培养基的基础上添加 0． 3%～ 0． 7% 的酵母提取物 及 0． 4%～ 1． 6% 玉米浆干粉进行氮源优化。 1． 3． 2 补料发酵工艺优化 1． 3． 2． 1 pH 的优化 流加稀盐酸调节 pH，将 pH
表 1 不同酵母提取物对生物量及多杀菌素产量的影响
生物量 / %
项目
灭菌后 48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 3% 15． 0 ± 0． 5 19． 7 ± 0． 4 22． 2 ± 0． 3 27． 0 ± 0． 4 27． 3 ± 0． 5 106． 0 ± 4． 0 酵母浸膏
（ 3） 多杀菌素发酵产量的测定［9］： 取发酵液 2 mL，加入无水甲醇 4 mL，充分振荡 30 min，转速4 000 r / min 离心 10 min，上清 14 000 r / min 离心 5 min，上 清液用 HPLC 测定多杀菌素的产量。色谱条件： waters 高效 液 相 色 谱 仪： C18 反 相 柱 （ 250 mm × 4． 0 mm） ； 流动相为甲醇∶ 乙腈∶ 水 = 45 ∶ 45 ∶ 10 （ v / v / v， 其中水含 0． 05% 乙酸铵） ； 流速 1． 0 mL / min； 检测 波长 244 nm； 进样量 10 μL； 柱温25 ℃ 。
2013 年“农业科技成果转化资金项目”（ 2013GB24490638） 作者简介： 邹球龙，1984 年出生，男，科研助理． 通讯作者： 张晓琳，1975 年出生，女，研究员．
数分析仪，美国 Nova 公司； Waters 515 /2487 型高效 液相色谱仪，美国 Waters 公司。 1． 2 菌种与培养基 1． 2． 1 菌种
Study on the fed － batch fermentation process of spinosad
ZOU Qiu － long，GUO Wei － qun，WANG Chao，HU Xiang，HAN Wei，ZHANG Xiao － lin （ Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）
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粮油食品科技 第 22 卷 2014 年 第 3 期
生物工程
分别控制在 6． 5、7． 0、7． 5 和 8． 0。 1． 3． 2． 2 残糖水平优化 补料工艺中，将基础葡萄 糖添加量由 60 g / L 降至 30 g / L，将残糖控制在不同 水平，对照为原工艺。 1． 4 相关参数检测
定生物量及产量，结果如表 3 所示。摇瓶筛选结果
表明添加一定量的玉米浆干粉有利于菌丝生长。随
着玉米浆干粉浓度的不断增加，生物量及产量先呈
上升趋势，在浓度为 1． 0% 时都达到最高。但是速 效氮源也存在类似于葡萄糖的阻遏效应［12］，随着玉
米浆干粉 的 继 续 增 加，生 物 量 的 变 化 表 现 出 抑 制 作用。
对照 15． 3 ± 0． 5 20． 9 ± 0． 4 22． 3 ± 0． 6 25． 1 ± 0． 5 26． 3 ± 0． 5 104． 0 ± 7． 0
0． 3% 15． 7 ± 0． 4 18． 0 ± 0． 5 20． 2 ± 0． 5 25． 5 ± 0． 5 25． 8 ± 0． 4 91． 0 ± 5． 0 酵母浸粉
对照 15． 2 ± 0． 4 16． 1 ± 0． 4 17． 7 ± 0． 5 19． 6 ± 0． 4 21． 0 ± 0． 4 53． 0 ± 5． 0
0． 7 15． 2 ± 0． 4 21． 1 ± 0． 5 22． 0 ± 0． 4 25． 0 ± 0． 4 26． 1 ± 0． 4 89． 0 ± 4． 0
2． 1． 2 玉米浆干粉对生物量及多杀菌素产量的
影响 在固定 0． 5% 酵母浸膏的基础培养基中，添
加不同比例的玉米浆干粉。分别培养不同时间后测
刺糖多孢菌 ASAGF73，本实验室保存。 1． 2． 2 培养基［7 － 8］
斜面及平板培养基（ g / L） ： 葡萄糖 5． 0，牛肉膏 3． 0，酪蛋白胨 0． 25，琼脂 18． 0。pH 7． 2 。
种子培养基（ g / L） ： 葡萄糖 15． 0，可溶性淀粉 10． 0，豆饼粉 3． 0，棉籽蛋白 3． 0，大豆蛋白胨 25． 0， MgSO4 2． 0。pH 7． 2。
1 材料与方法
1． 1 仪器设备 15 L 发酵罐，德国 satorius 集团； 30 L 及 50 L 发
酵罐，镇江东方生物工程设备有限公司； SBM / SS － X 摇床，瑞士 Kuhner 公司； Nova BioProfile 300 多参
收稿日期： 2013 － 11 － 18 基金项目：“十二 五”国家科技支撑计划课题 （ 2011BAD03B02 － 2 ） ；
1． 3 15． 6 ± 0． 5 21． 3 ± 0． 4 23． 3 ± 0． 4 25． 7 ± 0． 4 29． 6 ± 0． 4 93． 0 ± 6． 0
1． 6 15． 4 ± 0． 4 21． 6 ± 0． 6 23． 0 ± 0． 4 24． 7 ± 0． 4 26． 1 ± 0． 4 102． 0 ± 5． 0
表 2 酵母浸膏浓度优化结果
浓度 / % 灭菌后
生物量 / %
48 h
60 h
72 h
产量 / （ mg / L）
96 h
96 h
0． 3 14． 9 ± 0． 4 20． 6 ± 0． 5 22． 1 ± 0． 4 25． 1 ± 0． 4 26． 2 ± 0． 3 101． 0 ± 5． 0
0． 5 15． 7 ± 0． 4 21． 2 ± 0． 4 21． 3 ± 0． 3 26． 8 ± 0． 4 29． 6 ± 0． 4 105． 0 ± 3． 0