三七总皂苷在乙酸所致小鼠急性炎性内脏痛中的镇痛作用

• 扌艮告•
三七总皂昔在乙酸所致小鼠急性炎性 内脏痛中的镇痛作用*
*基金项目：湖北省自然科学基金项目（2014FGB324）
李霞董航于江
（江汉大学附属医院，湖北武汉430016）
中图分类号:R285.5文献标志码：A 文章编号:1004-745X （2019）07-1171-04
doi ：10.3969/j.issn.l 004-745X.2019.07.012
【摘要】目的分析三七总皂昔（PNS ）在乙酸所致小鼠急性炎性内脏痛中的镇痛作用。

方法选取成年雄性
昆明小鼠120只，随机分为对照组（n = 20只），生理盐水组（n = 50只），三七总皂昔组（n = 50只）。

对照组常规 条件下饲养，不做干预建立急性内脏痛模型；生理盐水组预先腹腔注射生理盐水，剂量为2.86 mL/kg ；三七总
皂昔组预先腹腔注射三七总皂昔7mg/mL,同时两组间隔12h 注射1次，持续7d,第8日腹腔注射1%乙酸
（10 mg/kg ）,建立急性内脏痛模型，即刻中观察昆明小鼠扭体反应。

结果乙酸腹腔注射后3 min 左右产生行
为学反应，生理盐水组在15-30 min 后扭体反应达到峰值，三七总皂昔组在30-45 min 出现反应高峰值；三 七总皂昔组和生理盐水组比较，0~15、15~30、45~60、60~75、120~135 min 后扭体反应明显减弱（P<0.05）；生 理盐水组、三七总皂昔组与对照组比较显著增加（P<0.05）；三七总皂昔组GFAP 表达显著低于生理盐水组
（P<0.05）。

结论乙酸所致小鼠急性炎性内脏痛模型预先经腹腔注射三七总皂昔可抑制脊髓胶质细胞的激
活，进•步缓解急性炎性内脏痛。

【关键词】急性内脏痛三七总皂昔乙酸扭体反应小鼠
Analgesic Effect of Panaxnotoginsengsaponins on Acute Inflammatory Visceral Pain in Mice Induced by
Acetic Acid Li Xia,Dong Hang, Yu Jiang. Jianghan University Affiliated Hospital ,Hubei , Wuhan 430016,
China.
[Abstract] Objective : To investigate the an a lgesic effect of panaxnotoginsengsaponins (PNS) on acute inflam ­
matory visceral pain in mice induced by acetic acid. Methods : 120 adult male Kunming mice were randomly di ­
vided into the control group (〃二 20), the normal saline group (n = 50),and PNS group(n = 50). The control group was fed under routine conditions without intervention to establish acute visceral pain model ； the saline group was given intraperitoneal injection of saline at a dose of 2.86 mL/kg ；PNS group was given intraperitoneal injection of
PNS 7 mg/mL beforehand. The two groups were injected once every 12 hours for 7 days. The acute visceral pain model was established by intraperitoneal injection of 1% acetic acid (10 mg/kg) on the 8th day. The writhing re ­
action of Kunming mice was observed immediately. Results : The behavioral response occurred about 3 minutes after the intraperitoneal injection of acetic acid. The writhing reaction reached a peak after 15-30 minutes in the normal saline group,and the high peak of the reaction occurred in PNS group in 30~45 minutes. The reaction of
the PNS group was significantly milder than that of the normal saline group at 0~15,15〜30,45~60,60〜75,120〜 135 minutes(P< 0.05). The expression of GFAP in the normal saline group and PNS group was significantly high ­
er than that in the control group (Pv 0.05),and that in PNS group was significantly lower than that in the normal saline group (P< 0.05). Conclusion : Pre-intraperitoneal injection of PNS can suppress the activation of spinal
glial cells and further alleviate acute inflammatory visceral pain in mice model with acute inflammatory visceral pain caused by acetic acid.
[Key words ] Acute visceral pain ；PNS ；Acetic acid ； Writhing response ；Mice
目前，神经科学的研究方面有了全新的进展，近期 公开的研究证实，星形胶质细胞与疼痛具有相关性；神
经胶质细胞的激活功能进一步使长期疼痛刺激中枢神
经系统产生病理性的重建，且星形胶质细胞在整个传 递环节中发挥主要作用2"。

临床中内脏痛（VP ）是普遍 的疼痛症状，常表现为损伤性刺激，使内脏器官伴痛
感，显著特性为确定准确位置难度高且感觉模糊，现阶
段针对内脏痛形成与传导原理尚未有报道4。

三七总
皂昔（PNS）是从中药三七提取的主要有效成分，具有消瘀散滞的功能，可修复神经元侵损。

此外，有关研究报道指出，PNS对谷草转氨酶具有调节与激活的功能，但对是否可改善急性内脏痛的研究较少⑺。

本研究采取三七总皂背腹腔注射昆明小鼠，建立急性炎性内脏模式，分析PNS对急性炎性内脏痛的镇痛效果。

现报告如下。

1材料与方法
1.1实验动物选取成年雄性昆明小鼠120只，SPF 级，体质量21-26g,由南华大学动物试验中心提供，动物认可证号SCXK（湘）2015-0002,自然光照下置不同笼中喂养，环境温度需控制在24-30°C,自由饮食水1周。

1.2试药与仪器三七总皂昔（云南三七科技有限公司生产，国药准字Z53021725）。

鼠/兔通用型IHC试剂盒（Auragene）；GFAP抗体（中杉金桥）;DAB显色试剂盒（武汉博士德）；光学显微镜（01ympusBX51）；戊巴比妥钠（Sigma）；冰冻切片机（LeicaCM1850）。

36%冰醋酸（台州市新宁制药有限公司，国药准字H44020291）,取0.1mL36%冰醋酸用无菌生理盐水稀释到3.6mL 混匀，即为1%乙酸，即配即用。

无菌生理盐水（浙江都邦药物股份有限公司，国药准字H33020614,规格为100mL：0.9g/瓶）。

多聚甲醛（天津科密欧化学试剂有限公司，国药准字H426025,规格AR/500g）。

蔗糖（西陇化工有限公司，国药准字H20083345）o
1.3模型制备既往研究实践发现，用生理盐水将乙酸稀释至1%,10mlAg经腹腔注射建立的内脏痛模型较为稳定，可诱发扭体反应，所以采用该剂量制作扭体模型顷。

成模后即刻开始观察小鼠扭体反应，计算方法:A为0分表示正常姿势；B为1分表示身体偏向一边倾斜；C为2分表示肢伸展、后爪多次往后摆动；D 为3分表示腹部肌肉出现收缩、后肢向外伸，得分越高，表示越疼痛。

乙酸注射后立即计数每15分钟出现的扭体反应次数，各等级扭体反应次数乘以相应分值的总和作为该时间段的扭体次数。

1.4分组与给药大鼠分为对照组（n=20只）、生理盐水组（n=50只）、三七总皂昔组（n=50只）。

对照组不做药物干预，经腹腔注射0.25mL1%乙酸，生理盐水组在小鼠疼痛扭体模型建立前1h,经腹腔注射
2.86m!7kg剂量的生理盐水；三七总皂昔组在小鼠疼痛扭体模型建立前lh,经腹腔注射7mg/mL三七总皂昔药液.1h后建立疼痛扭体模型，观察小鼠疼痛扭体反应。

1.5标本采集与检测扭体反应观察结束后，经腹腔注射2%戊巴妥钠40mg/kg麻醉小鼠，行开胸术，将心脏完全暴露，经左心室插管至升主动脉。

首先采取生理盐水高频率冲洗血管中的血液，于小鼠肝脏呈现白色结节后灌注冷的（4七）4%多聚甲醛，先快速后逐渐降低灌注速率;灌注期间应观察小鼠四肢抽搐情况，直至小鼠四肢僵硬后暂停灌注，去除脊髓腰紙膨大段，抽离脊髓外模，注入4%多聚甲醛后经24h固定，按顺序将15%与30%的蔗糖注入并观察梯度沉淀，在组织沉到30%的蔗糖底位后，连续冠状切片，片厚15*m,置入0.01mol/L的PBS中在2~4七保存待用。

采取免疫组化学法观察小鼠脊髓GFAP表达情况，显微镜下观察，取得满意显色效果后，经蒸懈水清洗，停止反应，经常规方法脱水、透明并封片。

1.6统计学处理应用SPSS20.0统计软件。

计量资料以（％土s）表示，比较采用单因素方差分析或t检验；相关性分析采用Person相关。

P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1各组扭体反应结果比较见表1。

乙酸腹腔注射后3min左右产生行为学反应，生理盐水组在15-30min 后扭体反应达到峰值，三七总皂昔组在30-45min出现反应高峰值。

三七总皂昔组和生理盐水组比较，0~ 15、15~30、30~45、60~75、120~135min后扭体反应明显减弱（P<0.05）。

表1两组扭■体反应评分比较（分，’±5）
组别n0~15min15-30min30~45min45-60min60~75min75-90min90~105min105-120min120-135min 生理盐水组5065.64±14.68127.64±13.57108.64±12.6998.64±11.5884.67±10.5962.74±9.7349.67±6.2429.25±5.7428.14±5.18三七总皂昔组5027.87±13.97*51.69±14.18*74.68±13.25*65.21±10.6942.41±9.85*32.15±9.2525.09±5.1821.01±4.9212.64±4.58*与生理盐水组同时间段比较，・P<0.05
2.2各组免疫组化结果比较见图1,见表2。

生理盐水组、三七总皂昔组腰紙膨大段脊髓背角GFAP表达水平较对照组显著增加（P<0.05）；三七总皂昔组GFAP 表达显著低于生理盐水组（P<0.01）o
3讨论
疼痛作为身体受侵害后传递到脑内的应激反应，表2各组腰旣膨大段脊髓背角GFAP表达水平比较（ng/L,x±5）组另ij n GFAP
三七总皂昔组5016.83土1.97^
生理盐水组5019.67±2.18*
对照组507.63±2.25与生理盐水组比较,-P<0.01；与对照组治疗后比较，纶<0.05
图1各组腰紙膨大段脊髓背角GFAP表达(DAB染色，100倍)
属于保护性的警觉作用，为不同疾病中普遍存在的痛觉反应何。

既往临床试验研究表明，啮齿动物具备较佳的模拟人类疼痛与有关情感行为变化的表达，所以建立成功的动物模型至关重要何。

其中以内脏痛模型较为常见，经注射诱发炎物质建立炎性内脏痛模型，腹腔注射化学物质造成自身组织侵损，传递信号于感受器伴伤害性反应，发生神经冲动，初期阶段通过感觉神经传导脊髓背角浅显投射，伴动物腹部肌肉剧烈收缩反应，部分伴后肢外伸，即为扭体反应。

有实验研究发现,经腹腔注射0.6%~9%浓度的冰醋酸均可使小鼠产生扭体反应，同时其扭体反应次数不同【5。

经相关研究提示，腹腔注射1%冰醋酸0.25mL制作炎性内脏痛模型，小鼠表达的扭体反应次数稳定，所以选用1%冰醋酸。

本研究发现，该模型存在个体性区别，但存在个例小鼠表现差异未产生扭体反应，与相关研究报道的8%动物并未伴扭体反应相符,应剔除
既往，大量专家与学者针对疼痛分析的重点于神经元及对应内容，尚未深入研究神经胶质细胞问。

近年来，部分研究提示，神经胶质细胞在疼痛发展、形成阶段均有参与，特别是脊髓星形胶质细胞两。

在病理性疼痛模型中，星形胶质细胞接收信号后活化，产生大量炎性因子，如TNF-a JL-lp、PGs、CX3CL1等，促炎性因子参与胶质细胞或神经元中，加剧疼痛反应。

近年来研究星形胶质细胞发现,GFAP作为星形胶质细胞的标志性蛋白，呈现特异性问。

临床大量研究发现，神经系统受侵损的制约下，星形胶质细胞大量释放，表达为细胞数目显著升高，体积显著增加，且突起生长与免疫阳性GFAP表达明显提高购。

有研究在多种神经病理性疼痛试验动物模型中发现，脊髓GFAP免疫组化染色显著提升，同时增强幅度与痛觉过敏表达为正相关性，进一步说明脊髓星形胶质细胞参与了神经损伤性疼痛过程叫
三七的主要成分是三七总皂昔，相关研究指出，三七总皂背具有保护神经系统的功用；脑短暂性出血再灌溉后，三七总皂昔可修复神经元的损伤。

在大鼠脊髓出现横断损伤后，三七总皂昔可对星形胶质细胞活性进行控制，提高运动功能恢复。

三七总皂昔作用于神经胶质细胞中后，可改善其活化作用，实现保护神经系统目的叫
本研究采用符合临床内脏痛诱发的疼痛原理具有相似性的扭体模型作为实验主体，发现星形胶质细胞中GFAP是主要特异性蛋白物，具备特异性；在神经系统被侵害的过程中，星形胶质细胞会受到刺激信号，常表现为细胞数目显著升高，体积显著扩大，且存在突起生长与免疫炎性GFAP表达升高；GFAP传递的阳性因子与星形胶质细胞活化具有相关性，激发活性的星形胶质细胞数量加大,GFAP表达显著增大。

乙酸腹腔注射后3min左右产生行为学反应，生理盐水组在15-30min后扭体反应达到峰值，三七总皂昔组在30~ 45min后出现反应高峰值，三七总皂昔组和生理盐水组对比,0-15J5-30.45-60,60-75,120-135min后扭体反应明显减弱，三七总皂昔具有防止机体发生炎症的作用，尤其对慢性炎症压制效果显著，如关节炎、血管内皮细胞炎症，利于神经元存活且可修复损伤，缩短其运动功能的恢复时间。

本研究结果提示生理盐水组与三七总皂昔组GFAP与对照组比较显著增加；三七总皂昔组GFAP表达显著低于生理盐水组，进一步说明在炎性内脏通中脊髓星形胶质细胞活化均有参与，三七总皂昔可进一步抑制星形胶质细胞的活化从而改善急性内脏痛。

综上所述，三七总皂昔预处理可缓解乙酸所致昆明小鼠的急性炎性内脏痛，其机制可能与三七总皂昔预处理抑制脊髓星形胶质细胞活化表达具有相关性。

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痛较有明显优势，特别是结石直径在5mm以下,疗效较好：37：；针刺联合中药或体外碎石术比单纯运用中药或体外碎石术在促进排石及止痛时间疗效更显著mW；穴位注射相比肌肉注射能更快地起到止痛作用型”：。

本研究结果可为针灸临床和科研提供新的选穴处方提供一定的思路和参考,但仍然存在不足之处，纳入文献辨证论治较少，故未进行辨证分析；国外研究文献较少，故仅纳入国内的临床文献，按照循证医学文章质量评价，现有文献质量不高等。

尽管如此，本研究依然可为现有临床和进一步高质量临床研究和机制研究提供一定的借鉴。

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