根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(1):103~107
*基金项目： “十一五” 国家科技支撑计划(No.2006BAD01A06)、 农业部行业计划(No.nyhyzx07­012)和国家杰出青年科学基金(No.30225028)。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授， 主要从事甘薯细胞工程与分子育种研究。

E­mail ： <liuqc@>. 收稿日期：
2007­04­26 接受日期： 2007­05­23 ·研究论文
· 根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得 *
臧 宁, 张美彦, 翟 红, 李雪琴, 王玉萍, 刘庆昌 **
(中国农业大学植物遗传育种系， 农业部作物基因组学与遗传改良重点开放实验室， 北京市作物遗传改良重点实验室，
教育部作物杂种优势研究与利用重点实验室，
北京 100094) 摘要: 以甘薯 （
(L.)Lam.） 品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料, 用根癌农杆菌介导法， 获得了表达
基因的抗除草剂转基因甘薯植株。

根癌农杆菌 （ ） 菌株 LBA4404 携带有 基因的双元载体 pCAM­
BIA3300,共计450个胚性细胞团用于遗传转化。

在添加 2mg/L 2,4­D 、 100mg/L Carb 和0.5mg/L PPT （phosphinothricin ）的固体 MS 培养基上选择培养 8周后，得到了19个PPT 抗性愈伤组织。

将这 19个抗性愈伤组织转移到添加 1mg/L ABA 、 100mg/L
Carb 和0.5mg/L PPT 的固体 MS 培养基上，
其中的10个抗性愈伤组织共再生出 103株拟转基因植株。

PCR 分析表明， 其中的 69株为转基因植株。

Southern blot 分析表明， 基因稳定地整合到转基因植株的基因组中。

除草剂喷洒试验结果表明， 转基因 植株具有高度除草剂抗性。

关键词:甘薯;农杆菌介导转化; 胚性悬浮细胞;除草剂; 转基因植株 中图分类号: S188
文献标识码: A
文章编号: 1006­1304(2008)01­0103­05
Generation of Transgenic Herbicide­Resistant Sweetpotato Plants
by ­mediated Transformation
ZANG Ning,ZHANG Mei­yan,ZHAI Hong,LI Xue­qin,WANG Yu­ping,LIU Qing­chang**
Generation of transgenic sweetpotato plants expressing
gene for herbicide resistance was achieved using
­mediated transformation and sweetpotato (
(L.)Lam.)cv.Lizixiang embryogenic
suspension cultures.Total 450embryogenic cell aggregates were cocultivated with strain LBA4404harboring a
binary vector pCAMBIA3300with the
gene.Eight weeks after selection on MS medium supplemented with 2.0mg/L 2,4­D,100
mg/L Carb and 0.5mg/L PPT (phosphinothricin),19PPT­resistant embryogenic calluses were produced.After transferred to MS medium supplemented with 1.0mg/L ABA,100mg/L Carb and 0.5mg/L PPT,10of them formed 103putative transgenic plants.PCR analysis indicated that 69plants were transgenic.Stable integration of the gene into the genome of transgenic plants was confirmed
by Southern blot analysis.Experiment result showed that transgenic plants exhibited functional expression of the
gene by
assay for herbicide
resistance.
;
­mediated transformation;embryogenic suspension cultures;herbicide;
transgenic plants
长期以来, 甘薯杂交不亲和性及低结实性等特 点， 严重限制了甘薯育种中的资源利用，
基因工程是 改良甘薯品种的一种有效方法。

目前， 甘薯基因工程 已经取得了一定进展，已经将豇豆胰蛋白酶抑制剂 基因 （
）、 植物凝集素基因
（ ）（Newell
.， 1995）、 啄­ 内毒素 芋 基因 (Mor 佗n
,1998)、 SKT1­4 基因 （Cipriani .,1999）、 淀粉粒附着性淀
粉合成酶玉基因 （GBSS 玉）（Kimura ,2001）、 烟
草微粒体 ω­3 脂肪酸脱氢酶基因（NtFAD3）
（Wakita ， 2001）、玉米醇溶蛋白酶基因（高峰
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
等， 2001）、 水稻巯基蛋白酶抑制剂基因 （ 玉）（蒋 盛军等， 2004； 阎文昭等， 2004）、 淀粉分支酶域基因 （ 域）（Shimada ,2006） 等导入到甘薯品种 中， 并获得少量转基因甘薯植株。

基因编码的 PPT­乙酰转移酶能使除草剂 Basta的有效成分 PPT（phosphinothricin） 乙酰化而 失活，因而被广泛应用于抗除草剂转基因作物的生 产中。

杂草对于甘薯的生长有很大的影响， 将 基 因导入甘薯中获得抗除草剂转基因植株具有重要的 经济价值。

Otani (2003)和 Yi（2007） 分别 利用农杆菌介导法（菌株 EHA101）和基因枪法将 基因导入甘薯品种的胚性愈伤组织，获得了对 除草剂具有一定抗性的转基因甘薯植株。

本研究利 用农杆菌菌株 LBA4404将 基因转入到甘薯品 种栗子香胚性悬浮细胞中，获得了对除草剂具有高 度抗性的转基因甘薯植株。

1材料和方法
1.1 植物材料
以甘薯 （ (L.)Lam.） 品种栗子香 的胚性悬浮细胞为受体材料。

胚性悬浮细胞的制备 参照 Liu .（2001）的方法，直径为 0.7～1.3mm 的胚性细胞团用于遗传转化。

1.2 农杆菌菌株及质粒
根癌农杆菌（ ） 菌株 为 LBA4404， 携带有 基因的双元载体 pCAMBIA3300（图 1）。

图1.双元载体 pCAMBIA3300的 T­DNA结构图 Fig.1.Schematic representation of the T­DNA region of binary
plasmid pCAMBIA3300
P:CaMV启动子； ,PPT抗性基因； T,35S终止子。

P, (CaMV) promoter; ,phosphinothricin resistance gene; T,CaMV terminator.
1.3 遗传转化
将携带有 pCAMBIA3300质粒的农杆菌菌株 LBA4404的单克隆振荡培养至
600
＝0.5， 5000 r/min离心 5min收集菌体，分别用 LB培养基和含 有 2mg/L2,4­D的液体 MS培养基洗涤后,用含有 2mg/L2,4­D的液体 MS培养基重悬菌体。

将胚性 悬浮细胞悬浮于菌液中 5min， 然后将菌液吸出， 将 侵染过的胚性细胞团在含有 2mg/L2,4­D和 30 mg/L乙酰丁香酮 （AS） 的固体 MS培养基上共培养 3d， 培养条件为 28 ℃、 黑暗。

1.4 选择培养及转基因植株的再生
共培养后的胚性细胞团用含有 2mg/L2,4­D和 500mg/L Carb的液体 MS培养基洗涤后， 将其在含 有 2mg/L2,4­D和 100mg/L Carb但不含有 PPT的 液体 MS培养基中培养 1周,然后在添加 2mg/L 2,4­D、 100mg/L Carb和 0.5mg/L PPT的固体 MS 培养基上进行选择培养， 培养条件为 28 ℃、 黑暗。

选 择培养 8周后，将得到的抗性愈伤组织转移到添加 1mg/L ABA、 100mg/L Carb和 0.5mg/L PPT的固 体 MS培养基上， 诱导体细胞胚的形成和发芽， 培养 条件为 28 ℃、 每日 13h、 3000lx光照。

将获得的小 植株进一步转移到添加 0.5mg/L PPT的 MS培养基 上使其发育成完整植株。

1.5PCR 和 Southern blot 分析
用 CTAB法 （Saghai­Maroof .,1984） 提取拟 转基因植株和未转化对照植株的基因组 DNA。

bar 基因 PCR引物为：
5'­ATG AGC CCA GAA CGA CGC­3';
5'­TCT CAA ATC TCG GTG ACG­3'。

目标产物 550bp。

在 0.2mL Eppendof离心管中 建立 25滋 L反应体系。

反应程序为 94 ℃变性 5 min， 58 ℃退火 30s， 72 ℃延伸 1min， 30个循环， 最 后 72 ℃延伸 5min。

1％（W/V） 琼脂糖凝胶电泳检测 扩增结果。

将转基因植株和对照植株的基因组 DNA及质 粒用 Ⅰ酶进行酶切， 酶切产物在 0.8％（W/V） 的 琼脂糖凝胶电泳中分离后转到 Hybond­N +正电尼龙 膜上，以 基因编码序列为探针进行 Southern blot。

探针标记、预杂交和杂交方法参照 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit域（罗 氏)说明书方法。

1.6 转基因植株的除草剂抗性检测
将转基因植株和未转化对照植株移栽到温室 中， 分别用含有 1000mg/L(正常大田剂量)和 2000 mg/L PPT的 Basta(拜耳作物科学公司)进行喷洒试 验， 以检测转基因植株对除草剂的抗性。

喷洒后观察 植株表现情况， 连续观察 4周。

2结果和分析
2.1 遗传转化及转基因植株的再生
共计
450个甘薯品种栗子香的胚性细胞团 (图 104
第 1期 臧 宁等:根癌农杆菌介导的抗除草剂转基因甘薯植株的获得
2， A) 用于转化。

在添加 2mg/L 2,4­D 、 100mg/L Carb 和 0.5mg/L PPT 的固体 MS 培养基上选择培 养 8 周后， 共得到 19 个 PPT 抗性胚性愈伤组织 (图
2， B)。

将这 19 个抗性胚性愈伤组织转移到添加 1 mg/L ABA 、 100mg/L Carb 和 0.5mg/L PPT 的固体
MS 培养基上， 其中的 10 个愈伤组织形成了体细胞 胚， 体细胞胚进一步发育成熟并形成小植株 (图 2，
C 、 D)。

将获得的小植株转移到添加 0.5mg/L PPT 的
MS 培养基上，共获得 103 株完整的拟转基因植株 (图 2， E)。

图2.甘薯品种栗子香转基因植株的再生及除草剂抗性表现
Fig.2.Production of transgenic plants from sweetpotato cv.Lizixiang and evaluation of herbicide resistance
A. 胚性悬浮细胞;
B. 在添加 2mg/L 2,4­D 、 100mg/L Carb 和 0.5mg/L PPT 的 MS 培养基上培养 8 周后获得的 PPT 抗性胚性愈伤组织 （TS ） , CK 为未转化的对照;
C. 在添加1mg/L ABA 、 100mg/L Carb 和0.5mg/L PPT 的MS 培养基上诱导得到的具有体细胞胚的愈伤组织;
D. 体细胞
胚的发芽和小植株的形成;E.在添加0.5mg/L PPT 的MS 培养基上获得的完整再生植株;F. 用1000mg/L PPT 处理 10d 后, 转基因植株 (TS) 和未转化对照植株 （CK ） 的除草剂抗性表现;G.用2000mg/L PPT 处理 4周后,转基因植株 (TS)和未转化对照植株 （CK ） 的除草剂抗性表现。

A.Embryogenic suspension cultures;B.PPT­resistant embryogenic calluses formed on MS medium with 2.0mg/L 2,4­D,100mg/L Carb and 0.5mg/L PPT after 8 weeks of selection culture (TS),CK,untransformed control;C.PPT­resistant embryogenic calluses with somatic embryos formed on MS medium supplemented with 1.0mg/L ABA,100mg/L Carb and 0.5mg/L PPT; D.Germination of somatic embryos and formation of putative transgenic plantlets;E.Whole plants obtained on MS medium supplemented with 0.5mg/L PPT;F.Transgenic plants displaying complete herbicide resistance (TS)and the untransformed control plants (CK)10days after spraying with 1000mg/L PPT;G.Transgenic plants displaying complete herbicide resistance （
TS ）and the untransformed control plants (CK)4weeks after spraying with 2000mg/L PPT. 105
农 业 生 物 技 术 学 报 2008年
2.2 转基因植株的分子检测
提取再生植株的总 DNA，以质粒 pCAMBIA 3300为阳性对照， 以未转化植株为阴性对照， 进行 PCR扩增。

结果表明， 其中 69株拟转基因植株的基 因组 DNA经 PCR扩增得到了 1条与预期长度一样 大小 （550bp） 的扩增产物， 而阴性对照及其余 34株 拟转基因植株未扩增到相应的片段，初步证明
基因已导入这 69株甘薯植株的基因组中 （图 3）。

图3.转基因植株中 基因的PCR检测
Fig.3.PCR analysis of the transgenic plants
M， DL2000;P， 质粒 pCAMBIA3300;C， 未转化对照植株;1～4、 10～ 12、 14～18， 转基因植株;5～9、 13， 非转基因植株。

M,DNA marker DL2000;P,plasmid pCAMBIA3300;C,the untransformed control plant;1 ～4,10 ～12and14 ～18,transgenic plants;5～9and13,non­transgenic plants.
为进一步证明 基因已经整合到转基因甘薯 植株基因组中， 随机选取 7株独立转化的 PCR阳性 植株进行 Southern blot分析。

转基因植株和未转化 对照植株的基因组 DNA以及质粒用 Ⅰ进行了 酶切。

杂交结果显示， 基因已经稳定整合到这 7株转基因甘薯植株的基因组中 （图 4）。

2.3 转基因植株的除草剂抗性检测
将获得的 69株转基因甘薯植株移栽到温室后， 在高湿度下其全部成活。

在温室中， 分别用含有 1000和2000mg/L PPT的Basta溶液进行喷洒。

结果表明， 用1000mg/L PPT喷洒10d后， 未转化对照植株的叶 片枯萎脱落， 最终整株死亡； 而转基因植株表现正常 (图2， F)。

2000mg/L PPT处理后， 对照植株很快枯死， 转基因植株叶片损伤明显，部分植株顶端新叶卷曲， 但在4周后叶片逐渐平展恢复正常(图2， G)。

图 4.转基因植株的 Southern blot分析 Fig.4.Southern blotting analysis of the transgenic plants
P,质粒pCAMBIA3300;C,未转化对照植株;1～7,转基因植株。

P,pCAMBIA3300;C,untransformed control plant;1～7,transgenic
plants.
3讨论
Otani (2003)利用农杆菌菌株 EHA101将 基因导入甘薯品种高系 14号中获得了抗除草 剂转基因植株，实验证明转基因植株叶片用 1000 mg/L双丙氨膦处理后明显受到损伤， 说明所获得的 转基因甘薯植株的除草剂抗性不高。

Yi .(2007)以甘薯品种 Yulmi为材料， 用基因枪法获得了少量 抗除草剂转基因甘薯植株，发现部分转基因植株对 0.3％（V/V） Basta溶液具有抗性。

本实验获得了大量 的表达 基因的转基因甘薯植株，而且所得到的 转基因甘薯植株的除草剂抗性显著高于 Otani (2003)和 Yi (2007)所获得的转基因甘薯植株 的除草剂抗性， 在用 2000mg/L PPT（大田使用剂 量的 2倍） 的 Basta溶液进行喷洒时， 仍表现出很高 的除草剂抗性。

因此， 将 基因导入甘薯品种， 能 够获得抗除草剂的转基因甘薯，使甘薯生产中的除 草作业更加方便、 经济。

Kan和 Hyg已经被广泛应用在甘薯遗传转化 的选择培养中。

本实验表明， 利用 基因作为选择 标记基因， 用较低的 PPT浓度就可以获得转基因甘 薯植株。

因此， 用 基因作为选择标记基因， 在获 得具有目标性状的转基因甘薯植株的同时，还可以 获得具有除草剂抗性的转基因甘薯植株，为甘薯品
种改良提供了一条有效途径。

参 考 文 献
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