乳腺癌组织中TPX2蛋白的表达及其临床意义

乳腺癌组织中TPX2蛋白的表达及其临床意义
张春梅;李敏;周仕娴
【摘要】目的：探讨TPX2蛋白在乳腺癌中的表达，分析其表达与临床病理特征的关系及其在乳腺癌治疗和预后中的意义。

方法应用免疫组化SP法检测乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织中TPX2蛋白的表达；应用RT-PCR技术检测乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织中TPX2 mRNA的表达。

结果 TPX2蛋白在乳腺癌组织中的表达(75．86%)显著高于癌旁(40．00%)及正常乳腺组织(5．00%)(P<0．01)，且TPX2蛋白表达与患者年龄、临床分期无明显相关性(P>0．05)；与组织学分级、淋巴结转移呈显著相关(P<0．01)。

TPX2 mRNA在乳腺癌组织中的表达(1．4657±0．1366)也显著高于癌旁(0．9233±0．1148)及正常乳腺组织(0．3269±0．0973)(P<0．01)。

结论 TPX2蛋白在乳腺癌中高表达，与乳腺癌组织学分级及淋巴结转移有一定的相关性，可能是乳腺癌发生、发展及淋巴结转移的危险因素。

%Purpose To investigate the expression of TPX2 in breast cancer, analyze the correlation between its expression and clinico-pathologic characteristics and explore the significances of TPX2 in the treatment and prognosis of breast cancer. Methods Expression of TPX2 in breast cancer tissues, adjacent tissue of cancer and normal breast tissue was examined by immunohistochenistry SP method. The mRNA expression of TPX2 in breast cancer tissues, adjacent tissue of cancer and normal breast tissue was detected by reverse-transcription polymerase chain reaction ( RT-PCR) . Results The expression of TPX2 is significantly higher in breast cancer tissues (75. 86%) compared with adjacent tissue of cancer (40. 00%) and normal breast tissue (5. 00%). And the expression of TPX2
cor-related with tumor grade and lymph node metastasis (P<0. 01), while unrelated to age and clinical stage (P>0. 05). The expression of TPX2 mRNA is also significantly higher in breast cancer tissues ( 1. 465 7 ± 0.
136 6 ) compared with adjacent tissue of cancer (0. 923 3 ±0. 114 8) and normal breast tissue (0. 326 9 ±0. 097 3) (P<0. 01). Conclusion High expression of TPX2 in breast cancer correlated with tumor grade and lymph node metastasis, so TPX2 might be a risk factor in the tumorigenesis, progression and lymph node metastasis in breast cancer.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2015(000)005
【总页数】4页(P528-531)
【关键词】乳腺肿瘤;TPX2蛋白;TPX2 mRNA;免疫组织化学
【作者】张春梅;李敏;周仕娴
【作者单位】重庆市江津区中心医院病理科 402260;重庆市江津区中心医院病理
科 402260;重庆市江津区中心医院病理科 402260
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
乳腺癌已成为威胁全球女性生命的严重疾病，发病率逐年上升，且出现年轻化趋势。

乳腺癌的发病机制复杂，病因尚不完全清楚。

近年研究发现，恶性肿瘤的发生是一个多因素、长期、分阶段的复杂过程。

与许多癌基因、抑癌基因及其产物的异常表达密切相关。

探讨乳腺癌发生、发展的基因对乳腺癌预防、早期诊断及预后判断至
关重要。

Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2，TPX2)是脊椎动物一个新的纺锤体成分家族，是一种受细胞周期严格调控的核增殖相关蛋白，对细胞有丝分裂纺锤体的稳定具有重要作用[1，2]。

体内、外实验均表明TPX2的过表达导致细胞中心体扩增，出现DNA异倍体及多倍体[3]，提示其异常表达可能与癌变和恶性肿瘤的进
展有关，阻断其表达可抑制肿瘤细胞的生长，有望成为肿瘤治疗的新候选靶点[4]。

TPX2与乳腺癌临床病理特征的关系国内报道较少，本文采用免疫组化SP法和
RT-PCR技术检测TPX2蛋白和mRNA在乳腺癌中的表达，探讨其表达与乳腺癌
临床病理特征的关系。

1.1 临床资料收集重庆市江津区中心医院病理科2011～2014年经病理诊断为乳腺癌的存档蜡块87例，均行免疫组化SP法检测，其中组织学分级:原位癌8例、Ⅰ级22例、Ⅱ级34例、Ⅲ级23例，所有病例术前均未行放、化疗及免疫治疗，另选20例癌旁组织(距肿瘤临床边界＜2 cm)和20例正常乳腺组织作对照。

用于RT-PCR检测的新鲜组织样品取自西南医院乳腺外科2014年3～8月的乳腺癌手
术切除标本，共20例。

1.2 主要试剂鼠抗人TPX2单克隆抗体购自美国Abcam公司，SP试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。

总RNA提取试剂盒购自日本Takara公司，RT-PCR试剂盒购自美国Promeg公司，TPX2和GAPDH引物由大连宝生物公司合成。

电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪(C1000 Thermal cycler)均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法
1.3.1 免疫组化所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，
4 μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸盐高温高压修复抗原，DAB显色，苏木精复染。

所有实验步骤严格按照SP试剂盒说明书进行。

TPX2抗
体稀释浓度为1∶500，用已知阳性切片(食管癌)作为阳性对照，用PBS代替一抗
作为阴性对照。

结果判定:以癌细胞核呈棕黄色颗粒为TPX2蛋白阳性。

判断标准
为随机计数10个高倍视野，观察100个细胞中阳性细胞所占百分比。

染色细胞比例＜10%为阴性；≥10%为阳性。

1.3.2 RT-PCR严格按照总RNA提取试剂盒说明书提取组总RNA，酶标仪测定
总RNA的浓度和纯度，OD260/OD280在1. 8～2. 0之间，常规琼脂糖凝胶证实RNA完整性，然后按照RT-PCR试剂盒进行逆转录。

PCR TPX2上游引物: 5'-TTTGGTATCAGACCCGAAGC-3'；下游: 5'-TCCCCATGTTTGTCAGTGAA-3'，扩增产物189 bp。

内参GAPDH上游引物: 5'-AGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3；下游: 5'-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3'，扩增产物532 bp。

PCR反应体系25 μl，反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环，再72℃终延伸10 min，最后取5 μl反应产物琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶成像仪上照相。

1.4 统计学分析应用SPSS 17. 0软件进行统计学分析，TPX2蛋白阳性率分析
行χ2检验，TPX2 mRNA表达水平数据应用珋x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

2.1 TPX2蛋白在正常乳腺、癌旁和乳腺癌组织中的表达TPX2蛋白阳性主要定位于肿瘤细胞的细胞核，呈棕黄色。

正常乳腺组织中TPX2的阳性率为5. 00%，
癌旁组织中的阳性率为40. 00%，乳腺癌组织中的阳性率为75. 86%，组间比较
差异均有统计学意义(χ2=37. 34，P＜0. 01，表1，图1～3)。

2.2 TPX2 mRNA在乳腺癌、癌旁和正常乳腺组织中的表达TPX2 mRNA在乳腺癌中的相对表达量(1. 465 7±0. 136 6)显著高于癌旁组织(0. 923 3± 0. 114 8)
及正常乳腺组织(0. 326 9±0. 097 3)，差异有统计学意义(P＜0. 01，图4)。

2.3 TPX2蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系TPX2蛋白表达与患者年龄、
临床分期无明显相关性(P＞0. 05)；与组织学分级、淋巴结转移呈显著相关(P＜0. 01，表2)。

乳腺癌是严重影响妇女身心健康甚至危及生命的常见恶性肿瘤，在欧美等发达国家乳腺癌的发病率较高，占女性恶性肿瘤的首位，其发病率逐年上升并出现年轻化趋势，而亚洲女性乳腺癌的发病率也有明显增高趋势。

目前，乳腺癌已成为威胁全球女性生命的严重疾病，早发现、早诊断和早治疗是改善乳腺癌预后的重要因素。

乳腺癌的临床治疗方法主要有手术切除、化疗、放疗、内分泌治疗及生物治疗，现基本采用综合治疗，虽然综合治疗能提高乳腺癌患者的长期生存率，改善生活质量，但5年生存率不高。

为此人们一直在探索新的治疗方法，尽可能提高患者的生存率。

寻找生物分子靶向治疗新靶点，成为目前乳腺癌治疗领域的研究热点。

TPX2蛋白位于人类染色体20q11. 2，是一种受细胞周期严格调控的核增殖相关蛋白，参与细胞有丝分裂的纺锤体微管功能[1，2]。

TPX2蛋白只在G1/S交界期开始可以被检测到，在胞质分裂完成后快速消失[5]。

在S和G2期，TPX2弥漫分布在整个细胞核，而在分裂期细胞与有丝分裂的纺锤体密切结合，使动力蛋白Xklp2靶向附着于纺锤体微管，从而保证正常的纺锤体极性[6]，具有促进肿瘤细胞增殖、影响凋亡及参与细胞周期调控的作用。

最近很多学者研究TPX2与恶性肿瘤的关系，证明TPX2在人类恶性肿瘤的发生、发展中可能起重要作用[7，8]。

Liu等[9]报道TPX2在肝癌细胞株中的表达显著高于正常肝细胞株，并且用siRNA 沉默TPX2的表达，抑制了肝癌细胞的侵袭及增殖，认为TPX2可以作为肝癌的治疗靶点进行分析，该观点与Huang等[10]报道的结果一致。

目前国际上对TPX2的相关分析多集中于该蛋白基础生理功能方面，国内有关TPX2的分析多集中于呼吸系统肿瘤和食管癌的分析。

Lin等[11]发现TPX2蛋白在肺鳞癌和永生化支气管上皮细胞系中均有水平不一的表达，且与肿瘤组织病理学分级、临床分期及淋巴结转移相关。

此外，还有学者对胰腺癌[12]、卵巢癌[13]、涎腺癌[14]、结肠癌[15]
和食管癌[4]中TPX2的表达进行分析，亦得到相似的结论，提示TPX2表达对恶
性肿瘤的生物学行为有预测价值，可作为形态学改变和预后的评价指标。

文献对TPX2蛋白与乳腺癌关系的分析报道较少，张惠球等[16]应用免疫组化法检测乳腺
癌和正常乳腺组织中TPX2蛋白表达，结果表明TPX2蛋白与乳腺癌的发生具有相关性，但缺少进一步研究。

本实验应用免疫组化SP法检测87例乳腺癌组织、20例癌旁组织及20例正常乳腺组织中TPX2蛋白的表达，结果显示TPX2蛋白在乳
腺癌组织中的表达(75. 86%)显著高于癌旁(40. 00%)及正常乳腺组织(5. 00%)，组间比较差异均有统计学意义(χ2=37. 34，P＜0. 01)。

本实验还应用RT-PCR检测20例乳腺癌组织、20例癌旁组织及20例正常乳腺组织中TPX2 mRNA的表达，结果显示TPX2 mRNA在乳腺癌组织中的表达(1. 465 7±0. 136 6)也显著高于癌
旁(0. 923 3±0. 114 8)及正常乳腺组织(0. 326 9±0. 097 3)(P＜0. 01)。

TPX2蛋
白和TPX2 mRNA在乳腺癌中的表达均明显高于癌旁及正常乳腺组织，提示TPX2可能参与了乳腺癌发生、发展的过程，其过表达可能是乳腺癌发生的危险因素，可作为乳腺癌细胞增殖的评估指标。

另外，TPX2蛋白表达水平与患者年龄、临床分期无明显相关性(P＞0. 05)，但与组织学分级、淋巴结转移呈显著相关(P＜0. 01)，提示TPX2蛋白的表达可能与临床预后有关，可作为肿瘤预后评价的指标。

综上所述，TPX2在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用，其与乳腺癌的组织学分级及淋巴结转移显著相关，可作为乳腺癌预后的重要指标。

TPX2作为一种新的、与多种恶性肿瘤的发生、发展相关的癌基因，进一步分析其表达和作用机制，有助于肿瘤的早期诊断和预后评价，有望找到特异且实用的针对异常TPX2信号通路的治疗方案，为肿瘤的诊治提供新靶点。

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