四川省7个特色桑品种RAPD分析

四川省7个特色桑品种RAPD分析
李萤;刘玲;张佳钰;范小敏;陈祥平;柯皓天;沈曦彤;陈仁芳
【摘要】利用RA PD方法对四川省的7个特色桑树品种进行了亲缘关系分析。

圌桑10号、盘桑2号与浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持亲缘关系近；圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号与斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑亲缘关系近；圌桑2号与广东荆桑亲缘关系近。

RA PD资料能将种以下的品种细分。

但RA PD聚类图将广东荆桑、圌桑2号首先分出，将钦州长果、重庆构树、云南长穗、荥经川桑、金佛山华聚在第一大类，结果难以解释，与中国植物志桑属的分类相矛盾。

建议在分析桑属的系统学时，先用ITS资料进行初步分类，确定亲缘关系大致框架，再用RAPD资料对种下不同品种进行细分。

%RAPD was used to analyze the genetic relationship among 7 special mulberry varieties from Sichuan Province .Phylogenetically ,Chuan Sang No .10 and Pan Sang No .2 were found to be closely related to Morus miz uho of Zhejiang and
M .mongolica var . diabolica and M . bombycis of Sichuan ,Chuan Sang
No .6 ,Chuan Sang No .12 ,Chuan Sang No .11 and Chuan Sang No .14 were closely related to Sri Lanka Sang ,M .mongolica of Baokang and
M .aust-ralis of Guangxi ,and Chuan Sang No .2 was closely related to
M .atropurpurea of Guang-dong .RAPD data can be used to subdivide mulberry varieties of subspecies .However ,based on the RAPD dendrogram ,M .atropurpurea of Guangdong and Chuan Sang No .2 were first separated ,and M .macrouraof Qinzhou ,Broussonetia papyrifera of Chongqing ,M .witti-orum of Yunnan ,M .notabilis of Yingjing and
M .cathayana of Jinfoshan were clustered in-to the first group .The above
results were difficult to explain ,for they were inconsistent with the classification of Morus in China Flora .It is recommended that in phylogenetic stud-iesy of Morus a preliminary classification be made based on the ITS data of the materials ,and then the RAPD data be used to classify different varieties of subspecies .
【期刊名称】《蚕学通讯》
【年(卷),期】2014(000)001
【总页数】7页(P12-18)
【关键词】四川省;特色桑品种;RAPD;亲缘关系;ITS;比较分析
【作者】李萤;刘玲;张佳钰;范小敏;陈祥平;柯皓天;沈曦彤;陈仁芳
【作者单位】西南大学生物技术学院，重庆 400716;西南大学生物技术学院，重
庆400716;西南大学生物技术学院，重庆400716;四川省丝绸工程技术研究中心，成都 610031;四川省丝绸工程技术研究中心，成都 610031;四川省丝绸工程技术
研究中心，成都 610031;西南大学生物技术学院，重庆 400716;西南大学生物技
术学院，重庆 400716
【正文语种】中文
桑树品种分子亲缘关系分析是桑树学科最基础研究，对桑树品种的保存、杂交育种亲本选择、分子辅助育种、品种资源开发利用均具有重要作用。

其分析方法已见核糖体DNA内转录间隔区（internal transcribed spacers，ITS）标记[1－4]，也
见于随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，
RAPD）标记[4－18]。

本文用RAPD方法对四川省桑树品种的7个特色亲缘关系
进行了分析，现将结果报道如下。

1 材料和方法
1.1 实验材料
实验材料取于四川省江油市蚕桑技术研究所桑品种园。

为了鉴定7个特色桑树品
种亲缘关系，参照董若铖等（2012）研究，选取浙江裂叶火桑、四川鬼桑、斯里
兰卡桑、荥经川桑、湖北蒙桑、新疆黑桑、云南毛叶奶桑、金佛山华桑、重庆构树、广东荆桑、钦州长果桑、广西鸡桑、云南长穗桑、剑持、咸丰长穗桑、云南光叶桑、滇桑为评鉴系统（表1）。

1.2 DNA提取及质量检测
总DNA提取采用稍加改进的CTAB法[20]，从约0.15g的硅胶干燥桑叶中提取，质量和浓度用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计（赛默飞世尔科技公司））
检测，并用1%琼脂糖凝胶电泳，λDNA/HindⅢmarker在紫外分光核酸测定仪（GENEQUANT，Eppendorf，Gemany）检测复核。

1.3 引物筛选
根据张有做等（1998）、赵卫国等（2000）、付大煦等（2005）、楼程富等（2002）的研究，用如下32个引物进行筛选。

表1 研究材料编号实验编号中文名拉丁名原产地类型四川江油叶材兼用评鉴系统1 2浙江裂叶火桑M.mizuho浙江杭州栽培2 6四川鬼桑M.mongolica
var.diabolica四川石棉野生3 10斯里兰卡桑M.alba斯里兰卡野生4 12荥经川
桑M.notabilis四川荥经野生5 21湖北蒙桑M.mongolica湖北保康野生6 26新疆黑桑M.nigra新疆和田半野生7 28云南毛叶奶桑M.macroura var.mawu云南西双版纳野生8 32金佛山华桑M.cathayana重庆金佛山野生9 44重庆构树（外类群）重庆北碚野生10 46广东荆桑M.atropurpurea广东顺德栽培11 67钦州
长果桑M.macroura广西钦州野生12 68广西鸡桑M.australis广西南宁野生13 77云南长穗桑M.wittiorum云南草坝野生14 81剑持M.bombycis日本栽培15 106咸丰长穗桑M.wittiorum湖北咸丰野生16 108云南光叶桑M.macroura云
南昆明野生17 110云南滇桑M.yunnanensts云南昆明野生待鉴定品种18 32（1）盘桑2号M.alba四川三台叶果兼用19 34（1）圌桑14号M.alba四川三台叶果兼用20 35（1）圌桑12号M.alba四川江油叶质优21 36（1）圌桑11号
M.multicaulis.日本高产量22 37（1）圌桑10号M.alba日本四边、间作23 38（1）圌桑6号M.atropurprea广东高产量24 39（1）圌桑2号M.alba
先用一个DNA样品，对引物初选，再用4个样品DNA进行第二次筛选，选出多态性高的引物用于RAPD实验。

1.4 PCR扩增及产物检测
RAPD扩增反应在Gene Company Limited PCR仪上进行。

反应总体积20μl，
其中含模板（TEMPLATE）1μl（25ng/μl）、10×PCR buffer 2μl、引物2μl
（50ng/μl）、Mg2＋2μl（2.5 mM）、dNTPs2μl（2.5mM）、Ex－taq 0.3μl （5U/μl），用ddH2O补至20μl，最后加矿物油0.3μl。

扩增程序为95℃预变性4min；95℃变性45s；36℃退火45s；72℃延伸90s；38个循环，72℃延伸
8min，反应结束控制在12℃。

每次PCR反应均设不含模板DNA的空白对照。

重复两次，确定所得条带的可重复性。

PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，电压110V（4V/cm，稳压）电泳约
20min，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色5～10min，在BIO－RAD Gel DocTM EZ Imager 2000凝胶成像系统（美国伯乐）拍照记录。

1.5 数据分析
根据扩增条带的迁移率，同一迁移率的条带用引物名＋分子量命名，有条带的记为
“1”，无条带的记为“0”，形成数据矩阵，按Nei's等的方法[21]，输入Popgen32软件（版本PHYLIP3.5）计算遗传相似度genetic identity（I）与遗传距离Genetic distance（D），根据遗传距离用邻接法聚类分析。

得到聚类图与ITS分支图比较。

2 研究结果
2.1 引物筛选及PCR扩增
32个引物第一次筛选，选出多态性高的17个引物。

第二次复选，选出多态性高的9个引物进行RAPD实验。

引物如下：
9个引物，对24个样品DNA进行扩增，共扩增出409条谱带，形成不同迁移率66条，平均每个引物扩增7.3条，片段大小在200～2 200bp，显示出丰富的多态性。

图1为J－20号引物扩增结果。

图1 J－20号引物RAPD－PCR扩增结果
2.2 遗传一致度（I）与遗传距离（D）
将有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，形成数据矩阵，输入Popgen32软件（版本PHYLIP3.5）计算遗传一致度（I）和遗传距离（D），计算结果：盘桑2号与剑持遗传距离最近（0.248 9）；圌桑14与金佛山华桑遗传距离最近（0）；圌桑12号与广西鸡桑遗传距离最近（0.145 7）；圌桑11号与金佛山华桑遗传距离最近（0.052 2）；圌桑10号与浙江裂叶火桑、保康蒙桑遗传距离最近（0.248 9）；圌桑6号与圌桑14号遗传距离最近（0.206 3）；圌桑2号与圌桑10号遗传距离最近（0.466 6）（表2）。

表2 四川省几个特色桑树品种遗传一致性和遗传距离表中对角线以上为遗传一致性genetic identity，对角线以下为遗传距离genetic distance。

表中1～24编号对应的材料名称与表1一致。

popID 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
17 18 19 20 21 22 23 288 0.7797 0.6610 0.4746 2 0.2274＊＊＊＊0.7458 0.7627 0.8305 0.6102 0.6102 0.8136 0.7458 0.5085 0.6780 0.7966 0.7627 0.8136 0.6610 0.5932 0.5593 0.7288 0.8136 0.7627 0.7966 0.7458 0.6949 0.4746 3 0.3399 0.2933＊＊＊＊0.8475 0.8136 0.5593 0.4915 0.7966 0.6949 0.5254 0.5593 0.8136 0.6441 0.7288 0.6102 0.5085 0.5424 0.7119 0.7966 0.7797 0.7458 0.7627 0.7797 0.4915 4 0.3640 0.2709 0.1655＊＊＊＊0.8305 0.5763 0.4746 0.9492 0.7797 0.4068 0.6441 0.9322 0.7627 0.6780 0.6271 0.5254 0.4915 0.6610 0.9492 0.8305 0.8983 0.6780 0.7627 0.3390 5 0.2709 0.1857 0.2063 0.1857＊＊＊＊0.5424 0.5424 0.8475 0.7797 0.5085 0.6780 0.8644 0.7288 0.7458 0.6610 0.5254 0.4915 0.6949 0.8475 0.7966 0.8305 0.7797 0.7627 0.4068 6 0.5512 0.4940 0.5810 0.5512 0.6118＊＊＊＊0.6271 0.6271 0.6610 0.5254 0.5254 0.6102 0.7119 0.5593 0.6441 0.5763 0.5763 0.5424 0.6271 0.5085 0.6441 0.6610 0.6102 0.5932 7 0.8194 0.4940 0.7102 0.7453 0.6118 0.4666＊＊＊＊0.5254 0.5593 0.5593 0.6271 0.4746 0.6441 0.5593 0.5424 0.7797 0.6780 0.4746 0.5254 0.3729 0.4746 0.4915 0.5085 0.4237 8 0.3399 0.2063 0.2274 0.0522 0.1655 0.4666 0.6436＊＊＊＊0.8305 0.4237 0.6949 0.9492 0.8136 0.6949 0.6441 0.5763 0.4746 0.6441 1.0000 0.8136 0.9492 0.7288 0.8136 0.3559 9 0.3887 0.2933 0.3640 0.2489 0.2489 0.4140 0.5810 0.1857＊＊＊＊0.4915 0.5932 0.8136 0.8475 0.7627 0.6441 0.6102 0.5424 0.7119 0.8305 0.7119 0.8136 0.7288 0.7119 0.4576 10 0.6118 0.6763 0.6436 0.8995 0.6763 0.6436 0.5810 0.8587 0.7102＊＊＊＊0.5932 0.4407 0.4746 0.5932 0.5763 0.5763 0.5424 0.5424 0.4237 0.4746 0.4407 0.5593 0.4746 0.5593 11 0.5512 0.3887 0.5810 0.4400 0.3887 0.6436 0.4666 0.3640 0.5222 0.5222＊＊＊＊0.6441 0.6102 0.6271 0.6441 0.6441 0.4746
0.4746 0.6949 0.6102 0.6780 0.5254 0.5763 0.4237 12 0.3163 0.2274 0.2063 0.0702 0.1457 0.4940 0.7453 0.0522 0.2063 0.8194 0.4400＊＊＊＊0.7966 0.7119 0.6610 0.5254 0.4915 0.6949 0.9492 0.8644 0.8983 0.7119 0.7966 0.3390 13 0.5222 0.2709 0.4400 0.2709 0.3163 0.3399 0.4400 0.2063 0.1655 0.7453 0.4940 0.2274＊＊＊＊0.7119 0.6949 0.6949 0.6271 0.6610 0.8136 0.6610 0.7966 0.6441 0.6949 0.3729 14 0.2933 0.2063 0.3163 0.3887 0.2933 0.5810 0.5810 0.3640 0.2709 0.5222 0.4666 0.3399 0.3399＊＊＊＊0.6780 0.6102 0.6102 0.7797 0.6949 0.7119 0.7119 0.6949 0.6441 0.5932 15 0.4666 0.4140 0.4940 0.4666 0.4140 0.4400 0.6118 0.4400 0.4400 0.5512 0.4400 0.4140 0.3640 0.3887＊＊＊＊0.6949 0.7627 0.5932 0.6441 0.5593 0.6271 0.6780 0.6610 0.5424 16 0.6436 0.5222 0.6763 0.6436 0.6436 0.5512 0.2489 0.5512 0.4940 0.5512 0.4400 0.6436 0.3640 0.4940 0.3640＊＊＊＊0.8305 0.5254 0.5763 0.4237 0.5593 0.5763 0.5932 0.4746 17 0.5810 0.5810 0.6118 0.7102 0.7102 0.5512 0.3887 0.7453 0.6118 0.6118 0.7453 0.7102 0.4666 0.4940 0.2709 0.1857＊＊＊＊0.6271 0.4746 0.3898 0.4576 0.5763 0.5593 0.5085 18 0.3640 0.3163 0.3399 0.4140 0.3640 0.6118 0.7453 0.4400 0.3399 0.6118 0.7453 0.3640 0.4140 0.2489 0.5222 0.6436 0.4666＊＊＊＊0.6441 0.6949 0.6610 0.7797 0.6271 0.5763 19 0.3399 0.2063 0.2274 0.0522 0.1655 0.4666 0.6436 0.0000 0.1857 0.8587 0.3640 0.0522 0.2063 0.3640 0.4400 0.5512 0.7453 0.4400＊＊＊＊0.8136 0.9492 0.7288 0.8136 0.3559 20
0.2274 0.2709 0.2489 0.1857 0.2274 0.6763 0.9865 0.2063 0.3399 0.7453 0.4940 0.1457 0.4140 0.3399 0.5810 0.8587 0.9420 0.3640 0.2063＊＊＊＊0.7966 0.7119 0.6949 0.4068 21 0.3163 0.2274 0.2933 0.1072 0.1857 0.4400 0.7453 0.0522 0.2063 0.8194 0.3887 0.1072 0.2274 0.3399 0.4666 0.5810
0.7817 0.4140 0.0522 0.2274＊＊＊＊0.7797 0.7627 0.4068 22 0.2489
0.2933 0.2709 0.3887 0.2489 0.4140 0.7102 0.3163 0.3163 0.5810 0.6436 0.3399 0.4400 0.3640 0.3887 0.5512 0.5512 0.2489 0.3163 0.3399 0.2489＊＊＊＊0.7797 0.6271 23 0.4140 0.3640 0.2489 0.2709 0.2709 0.4940 0.6763 0.2063 0.3399 0.7453 0.5512 0.2274 0.3640 0.4400 0.4140 0.5222 0.5810 0.4666 0.2063 0.3640 0.2709 0.2489＊＊＊＊0.5085 24 0.7453 0.7453
0.7102 1.0818 0.8995 0.5222 0.8587 1.0330 0.7817 0.5810 0.8587 1.0818 0.9865 0.5222 0.6118 0.7453 0.6763 0.5512 1.0330 0.8995 0.8995 0.4666 0.6763 24 1＊＊＊＊0.7966 0.7119 0.6949 0.7627 0.5763 0.4407 0.7119 0.6780 0.5424 0.5763 0.7288 0.5932 0.7458 0.6271 0.5254 0.5593 0.6949 0.7119 0.7966 0.7＊＊＊＊
2.3 聚类分析
基于Nei's（1979）遗传距离、RAPD资料、邻接法，UPGMA聚类，得聚类图。

圌桑10号、盘桑2号与浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持亲缘关系近；圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号与斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华亲缘关系近；圌桑2号与广东荆桑亲缘关系近。

聚类图首先将广东荆桑、圌桑2号分出，将其它材料聚为2大类。

第一大类比较复杂：钦州长果桑单独分出；圌桑10号、盘桑2号、浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持聚为一支，圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号、斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华聚为一支，重庆构树与云南长穗桑被聚在第一大类二支之间；第二大类包括新疆黑桑、云南毛叶奶桑、咸丰长穗桑、云南光叶桑、云南滇桑（图1）。

3 讨论
3.1 RAPD资料聚类分析能将供试的桑树品种细分
基于RAPD聚类图，能很好地将供试的四川7个特色桑树品种分开。

如圌桑10号、盘桑2号与浙江裂叶火桑、四川鬼桑、剑持聚在一起；圌桑6号、圌桑12号、圌桑11号、圌桑14号与斯里兰卡桑、保康蒙桑、广西鸡桑、荥经川桑、金佛山华
聚在一起；圌桑2号与广东荆桑聚在一起。

而基于ITS资料分支图，并没有将供
试的品种完全分开。

图1 基于UPGMA 7个特色桑品种聚类图
3.2 RAPD资料适合种内亲缘关系分析，不适合种以上亲缘关系分析
RAPD资料属等位基因频率资料，适合种内水平亲缘关系的分析。

在分析桑属种间或属间的亲缘关系时，由于不同种的扩增片段有时并不同源[22－24]，聚类分析
结果与中国植物志桑属的分类相矛盾，难以解释。

如本研究广东荆桑与圌桑2号
首先分出；将钦州长果桑聚在第一大类，单独分出；将荥经川桑、金佛山华桑聚在第一大类，均反映了RAPD资料分析桑属种以上水平亲缘关系的缺陷。

3.3 RAPD资料无法设定外类群
随机扩增片段长度多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技术由Willams和Welsh等先后于1990提出[25－26]。

该技术是建立
在DNA聚合链式反应（Polymerase Chain reaction，PCR）基础上，对未知序
列的基因组进行多态性分析的分子技术。

以单个人工随机合成的寡核苷酸为引物，以生物的基因组DNA为模板，在Taq酶的作用下，进行PCR扩增反应，用扩增
产物不同长度来检测DNA的多态性。

用该多态性反映基因组的多态性，进而分析亲缘关系。

该方法无法假定外类群，只能将RAPD扩增片段转换成“0”“1”数据，用遗传相似性和遗传距离分析亲缘关系。

例如本研究实验材料构树是作为外类群参与分析，由于无法设定外类群，在聚类图却聚在了第一大类两支之间，难以解释。

通过比较本研究聚类图与董若铖等，2012基于ITS分支图，两种资料各有长处，
建议在分析桑属的系统学时，先用ITS资料进行初步分类，确定亲缘关系大致框架，再用RAPD资料对种下不同品种进行细分。

参考文献
[1]史全良，赵卫国.桑树ITS序列测定及特点的初步分析[J].蚕业科学，2001，27（2）：140－142.
[2]赵卫国，潘一乐，张志芳.桑属植物ITS序列研究与系统发育分析[J].蚕业科学，2004.1.
[3]陈仁芳，余茂德，刘秀群，等.桑种质资源ITS序列与系统进化分析[J].中国农业科学，2010，43（9）：1771－1781.
[4]董若铖，陈祥平，范小敏，等.四川几个特色桑树品种ITS序列与亲缘关系分析[J].四川蚕业，2012（2）：4－7.
[5]菅贵史，平田丰，町内秀纪，等.利用RAPD技术评价桑品种（日文）[J].日本
蚕丝学会第65次讲演要旨，1995.
[6]向仲怀，张孝勇，余茂德，等.采用随机扩增多态性DNA技术（RAPD）在桑
属植物系统学研究的应用初报[J].蚕业科学，1995（4）：203－208.
[7]楼程富，张有做，张耀洲，等.桑树随机扩增DNA多态性研究[J].浙江农业大学学报，1996，22（2）：149－151.
[8]冯丽春，杨光伟，余茂德，等.桑树栽培种的随机扩增DNA多态性（RAPD）
研究[J].蚕业科学，1996，23（3）：153－159.
[9]冯丽春，杨光伟，余茂德，等.利用RAPD对桑属植物种间亲缘关系的研究[J].
中国农业科学，1997，30（1）：52－56.
[10]张有做，楼程富，周金妹，等.不同倍性桑品种基因组DNA多态性比较[J].浙
江农业大学学报，1998，24（1）：79－81.
[11]赵卫国，潘一乐，黄敏仁.桑属种质资源的随机扩增多态性DNA研究[J].蚕业
科学，2000，26（4）：398－402.
[12]赵卫国.桑种质资源的随机扩增多态性DNA（RAPDs）及叶绿体基因组DNA
的研究[D].北京：中国农业科学院，2001.6.
[13]赵卫国，潘一乐，黄敏仁.桑属种质资源的随机扩增多态性DNA研究[J].蚕业
科学，2002.4.
[14]焦锋，楼程富，张有做，等.桑树变异株系基因组扩增多态性（RAPD研究[J].
蚕业科学，2001，27（3）：165－169.
[15]杨光伟，冯丽春，敬成俊，等.桑树种群遗传结构变异分析[J].蚕业科学，2003，29（4）：6－12.
[16]杨光伟.中国桑属（Morus L.）植物遗传结构及系统发育分析[D].重庆：西南农业大学，2003b：24－29，51－74.
[17]傅大煦，张辉，陈纹，等.新疆药用桑树9个栽培群体的RAPD分析[J].中草药，2004，35（9）：3501－6501.
[18]买买提依明，吴丽莉，郭洪荣，等.新疆桑种质资源随机扩增DNA多态性（RAPD）研究[J].蚕业科学，2004（1）：112－114.
[19]付大煦.新疆桑属植物栽培居群的遗传多样性研究[J].西北植物学报，2005（2）：772－783.
[20]Weising K H，Wolff K，Meyer W.DNA Fingerprinting in Plants and Fungi.Boca Raton[J].Florida，US：CRC cPress，1995：50－54.
[21]Nei N.Mathematical model for studyig genetic variation in tem of restriction endonuclease[J].Proc.Natl.Acad A，1979，76（3）：5269
－5273.
[22]汪小全，邹喻苹，张大明.银杉遗传多样性的RAPD分析[J].中国科学（C辑），1996（5）：436－441.
[23]汪小全，邹喻苹，张大明.RAPD应用于遗传多样性分析和系统学研究中的问题[J].植物学报，1996（12）：954－962..
[24]马文辉，何平，袁小凤，等.RAPD标记在植物系统进化研究中的应用[J].西南师范大学学报（自然科学版），1999，24（4）：482－491.
[25]Williams J K.et al.DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucteic Acid Res，1990，18：6531－6535. [26]Welsh J，Mcclelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arimers[J].Nucteic Acid Res，1990，18（24）：7213－7218.。