丙型肝炎病毒核心蛋白与NS4B融合蛋白的构建和表达

丙型肝炎病毒核心蛋白与NS4B融合蛋白的构建和表达
房玉珠;朱燕;叶森;姚冬明
【摘要】目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(core)与NS4B融合表达克隆,并在大肠埃希菌中表达.方法:应用PCR方法从抗HCV阳性血清中扩增出HCV核心蛋白基因和NS4B基因的cDNA片段,将两部分基因片段拼接成一条完整cDNA,连接到表达载体pET28a上,菌落PCR和测序方法选择阳性核心蛋白-NS4B-pET28a 重组质粒.将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BI21中进行表达,分别用SDS-PAGE 和蛋白质印迹分析表达的重组融合蛋白.结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示,成功获得核心蛋白基因和NS4B基因,并成功拼接成一条完整cDNA;菌落PCR和测序结果表明重组融合克隆核心蛋白-NS4B-pET28a构建成功.SDS-PAGE结果表明重组融合质粒在大肠埃希菌BL21中成功表达,蛋白质印迹结果显示表达的重组蛋白与抗HCV阳性血清具有反应性.结论:成功构建了HCV核心蛋白与NS4B的重组融合克隆,并成功在大肠埃希菌中表达.%Objective:To construct a fusion gene clone of hepatitis C virus (HCV) core protein and NS4B and to check it expression in E.coli.Methods:cDNA fragments of HCV core gene and NS4B gene were separately amplified from the anti-HCV positive sera by PCR,followed by connecting them to form an intact cDNA and inserted into the expression vector pET28a.Positive recombinant plasmid named coreNS4B-pET28a was screened and confirmed by colony PCR and DNA sequencing.Mterwards it was transformed into E.coli BL21 to express recombinant fusion protein,which was analyzed by SDS-PAGE and Western
blotting.Results:Agarose gel electrophoresis showed that core gene and NS4B gene as well as the corresponding cDNA consisting of them were
obtained successfully.Colony PCR and DNA sequencing showed that the plasmid core-NS4B-pET28a was constructed successfully.SDS-PAGE clearly demonstrated the successful expression of the fusion protein in E.coli
BL21.Western blotting showed that the protein had reactivity with anti-HCV positive sera.Conclusion:The fusion expression vector for core gene and NS4B gene of HCV was successfully constructed and the protein was expressed successfully in E.coli.
【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2017(027)006
【总页数】4页(P470-473)
【关键词】丙型肝炎病毒;核心蛋白;NS4B;构建;表达
【作者】房玉珠;朱燕;叶森;姚冬明
【作者单位】江苏大学附属人民医院检验科,江苏镇江212002;江苏大学附属人民
医院检验科,江苏镇江212002;南京诺尔曼生物技术有限公司,江苏南京210031;江
苏大学附属人民医院检验科,江苏镇江212002
【正文语种】中文
【中图分类】R512.63
目前对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的临床检测方法仍然面临诸多问题。

对丙型肝炎的诊断主要依赖于对HCV抗体的检测，但抗体的产生有“窗口期”的特点，平均约为70 d，且有部分患者为静默感染。

仅检测HCV抗体，很难做到早期诊断、控制血源质量或解决HCV抗体假阴性的问题。

PCR检测HCV常出现
假阳性和假阴性的现象，标本处理过程中标本处理不当、微量DNA污染或RNA
丢失、引物设计、质量控制等原因均可造成检测结果不稳定、重复性差［1］。

因此，优化或建立高灵敏度和特异性的HCV检测方法对丙型肝炎的发现和控制具有重要意义。

本研究构建了HCV核心蛋白与NS4B融合重组蛋白，并在大肠埃希菌中进行表达，旨在为HCV抗体的制备及相应诊断方法的建立提供重要的资料。

血清标本为2016年我院通过酶联免疫（EIA）双试剂测定筛查抗-HCV阳性标本；病毒RNA提取试剂盒（DP315-R）购自北京天根生化科技有限公司；原核表达载体 pET28a、大肠埃希菌 Top10和BL21均为本实验室保存。

PrimeScriptⓇ1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA标准参照物 DL2000、限制性内切酶Bam
HⅠ和XhoⅠ、Ex Taq酶、T4 DNA连接酶等为TaKaRa公司产品；PCR回收试
剂盒、质粒提取试剂盒为AXYGEN公司产品；HRP标记的山羊抗人IgG二抗购
自北京索莱宝科技有限公司；DAB试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；根据
核心蛋白基因和NS4B基因序列设计引物，P1：ATAGGATCCAGCACAAATCCAAAACCCCA（下划线为Bam HⅠ酶切位点），
P2：GGCGGAAGCTGGGATGGTC，P3：GACCATCCCAGCTTCCGCCGCCTCGCACCTCCCTTACATC，P4：TATCTCGAGTTAGCATGGCGTGGAGCAGTCCTC（下划线为XhoⅠ酶切位点），由上海生物工程公司合成；其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2.1 HCV RNA的提取从140μL血清标本中提取病毒RNA，溶于60μL洗脱液中，-80℃保存。

提取步骤按病毒RNA提取试剂盒说明书操作。

1.2.2 逆转录扩增HCV cDNA第1条链用PrimeScriptⓇ 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行逆转录，具体步骤如下：配制反应体系随机6核苷酸引物
（50μmol/L）lμL，dNTP混合液（dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10 mmol/L）
1μL，HCV RNA 0.5μL，无RNA酶水7.5μL，总体积10μL，在PCR仪上65℃
变性5 min，然后在冰上急冷。

在上述反应液中补加逆转录酶缓冲液4μL，RNA
酶抑制剂（40 U/μL）0.5μL，逆转录酶（200 U/μL）1μL，无 RNA酶水4.5μL，于PCR仪进行反应，反应条件为30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5 min。

反
应后产物即为HCV cDNA第1条链，4℃保存备用。

1.2.3 HCV核心蛋白基因及NS4B基因的PCR扩增和拼接根据HCV基因组设计
基因片段引物，引物中包含Bam HⅠ、XhoⅠ酶切位点，由金斯瑞生物科技有限
公司合成。

核心蛋白基因使用P1、P2两条引物扩增，NS4B基因使用P3、P4两条引物扩增，PCR体系为引物各0.5μL，dNTP混合液（dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10 mmol/L）5μL，Ex Taq酶缓冲液5μL，Ex Taq酶1μL，HCV cDNA 第1条链1 μL，双蒸水37μL；PCR反应条件为94℃ 5 min，然后94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 40 s，共30个循环，最后72℃5 min。

以该扩增产物作为模板，使用引物P1、P4将核心蛋白基因和NS4B基因拼接在一起，PCR反应体系如上，反应条件中除72℃延伸时间为90 s外，其他条件与上述一致。

用1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。

1.2.4 HCV重组质粒的构建与鉴定用限制性内切酶Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切核心蛋白-NS4B基因片段和质粒pET28a。

琼脂糖凝胶电泳分离后洗脱回收，在T4 DNA连接酶作用下连接重组，转化Top10感受态细菌。

用PCR法筛选阳性克隆
并挑选阳性克隆送金斯瑞生物公司测序。

1.2.5 HCV核心蛋白-NS4B融合蛋白的表达与鉴定将测序正确的重组质粒核心蛋
白-NS4B-pET28a转化BL21感受态细胞，挑取重组菌单菌落于含卡那霉素的LB
培养基中，37℃振荡培养过夜。

第2天以1∶100的比例接种菌液扩大培养，至对数生长期［D（600 nm）＝0.6］后，加 IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导培养
5 h，4 000 r/min离心收集菌体。

取样品按常规法进行SDS-PAGE检测。

1.2.6 蛋白质印迹分析表达的重组融合蛋白将表达的融合蛋白经SDS-PAGE（12%分离胶）电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，封闭、洗涤后，一抗选用人抗HCV阳性血清，二抗选用山羊抗人IgG-HRP（1∶500），然后DAB试剂盒染色观察。

从抗HCV阳性血清中提取病毒RNA，并逆转录获取cDNA，以此为模板分别使
用引物P1、P2和P3、P4扩增核心蛋白基因和NS4B基因，其大小分别为573 bp、783 bp，琼脂糖凝胶电泳图谱表明成功获得了核心蛋白、NS4B基因片段（图1）。

然后将核心蛋白和NS4B基因混合物作为模板，使用P1、P4引物进行PCR拼接扩增，琼脂糖凝胶电泳分析，在大小1 374 bp位置有明显条带，与预期片段大小相符（图2）。

使用限制性内切酶将核心蛋白-NS4B基因片段连接在表达载体pET28a上，转化
大肠埃希菌Top10后，挑取单菌落PCR鉴定插入子，琼脂糖凝胶电泳分析表明挑取的5个克隆中有4个为阳性克隆（图3）。

挑取阳性克隆送金斯瑞生物公司测序，结果表明插入的基因序列完全正确。

将测序正确的重组质粒转化到大肠埃希菌BL21中表达，经 IPTG诱导表达后，将蛋白进行SDS-PAGE分析，在51 kD位置有明显目的条带，与预期大小相符（图4）。

使用人抗HCV阳性血清对表达的蛋白进行蛋白质印迹分析，在目的蛋白大
小位置上有明显条带，而阴性对照组没有相应条带（图5），结果表明表达的重组核心蛋白-NS4B融合蛋白具有抗体反应性。

HCV感染是导致慢性肝病、肝硬化、终末期肝病和肝癌的主要原因，也是肝移植
的一个重要指征。

目前，对HCV感染致病的分子机制尚不清楚，药物治疗作用有限，且HCV尚无有效疫苗，一种针对HCV外膜蛋白的疫苗正在研究中，基于抗
原的不同获取方法，免疫源性有很大差异，是疫苗制备的难点［2］。

因此，早期诊断、早期治疗是防止HCV传播的有效手段，同时加强血制品HCV监测，控制
传染源，可有效减少丙型肝炎的发生。

HCV的核酸为RNA，有9 500～10 000个碱基对［3］，属于黄病毒家族，包含两端的非编码区（5′UTR、3′UTR）和中间一个大的开放读码框（ORF）。

其基因组的ORF编码的多聚蛋白前体在翻译过程中及翻译后可经宿主细胞和病毒蛋白酶
剪切成3种结构蛋白（核心蛋白、E1、E2）及7种非结构蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。

HCV核心蛋白是HCV病毒颗粒的重要组成部分，氨基酸序列相对保守，基因组有573个碱基。

核心蛋白可与内质网膜、脂质体、线粒体膜和核膜发生关联反应，也可与多种细胞蛋白相互作用，对宿主细胞内的基因转录、脂类代谢、凋亡和各种信号通路产生重要影响，直接或间接地参与肝炎和肝癌的发生。

NS4B是HCV的一个非结构蛋白，其编码基因位于病毒基因组
的5 475～6 257核苷酸位点，编码第261位氨基酸残基的疏水蛋白。

NS4B相对于其他非结构蛋白在病毒进化上较为保守，是HCV三代诊断试剂盒中的主要抗原。

迄今为止，对于NS4B的功能尚不十分明确，目前的研究揭示NS4B定位于内质网，可能诱导内质网膜结构的改变，以优化其膜结构而有利于病毒复制或重组过程。

NS4B可通过多种途径影响宿主细胞及宿主免疫情况，在感染慢性化及肝炎发生过程中起着重要作用。

NS4B抑制宿主细胞蛋白的翻译、诱导内质网膜形态改变，减少感染细胞表面蛋白的转运，从而抑制宿主的免疫反应。

在一定程度上，NS4B还可以减弱机体对抗病毒药物INF-α的反应，同时逃避宿主对病毒的免疫。

有实验
表明NS4B可通过CREB-RP/ATF6β调节某些由内质网应激引起的细胞反应［4］。

NS4B也可同其他的蛋白互相影响共同介入病毒的存活与复制。

目前，检测抗-HCV主要用酶联免疫法（ELISA），操作简便、快速、敏感，不易
污染，特别适合我国基层医疗机构使用，但其所用抗原主要依赖于进口。

外源蛋白在大肠埃希菌中表达具有经济、方便、快速的特点，设计核心蛋白基因与NS4B
基因融合表达既可以同时提供两种抗原材料，又可以在后续研究中降低工艺的复杂性。

第3代HCV抗体诊断试剂与前两代诊断试剂相比，灵敏度和特异度都有所提
高，核心蛋白抗体出现较早，有较强的抗原性和特异性，NS4B蛋白抗体出现较晚，二者相互补充，可以获得较高的阳性率，缩短检测“窗口期”。

但是由于其为间接ELISA检测法，仍然难以克服假阳性和“窗口期”过长的问题［5］。

现有的第4
代HCV诊断试剂为直接ELISA法，具有很高的灵敏度和特异性，也能较早地检测出早期出现的IgM抗体，但由于HCV抗原的复杂性和标记方法的影响，该诊断
试剂并未能全面地推向市场，且该诊断试剂也存在一定的假阳性率。

本研究从人抗HCV阳性血清中提取了病毒RNA，并成功获得了核心蛋白和NS4B 基因，成功构建了核心蛋白-NS4B融合表达载体，并在大肠埃希菌中成功表达，
具有特异反应性。

利用基因工程技术生产出质优、廉价的重组核心蛋白-NS4B融
合蛋白抗原，可进一步补充和完善第4代HCV检测试剂；另一方面，可利用单克隆抗体技术经过两种亲本细胞的选择与制备、细胞融合、细胞的筛选与克隆化等步骤，制备高纯度的重组核心蛋白-NS4B融合蛋白单克隆抗体，提高ELISA检测试
剂盒的敏感性及特异性，也为疫苗的研制提供更多可能性。

【相关文献】
［1］李育芬，楚承霞，杨颖.HCV检测方法研究进展及其临床意义［J］.中国卫生检验杂志，2013，23（5）：1342-1344.
［2］殷丽.丙型肝炎实验室诊断技术研究进展［J］.山西医药杂志，2013，42（10）：1123-1124.
［3］Ke PY，Chen SS.Hepatitis C virus and cellular stress response：implications to molecular pathogenesis of liver diseases［J］.Viruses，2012，4（10）：2251-2290.
［4］Tong WY，Nagano- Fujii M，Hidajat R，et al. Physical interaction between hepatitis
C virus NS4B protein and CREB-RP/ATF6β［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，
299（3）：366-372.
［5］孙涛，杨光文，张金阳，等.丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备［J］.生物工程学报，2015，31（5）：711-721.。