表没食子儿茶素没食子酸酯对乙肝病毒复制的体外抑制作用及其机制

乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染可引起急、慢性肝炎 和重型肝炎，我国是 ＨＢＶ感染大国。目前临床上主 要采用 α干扰素 （ＩＦＮα）和核苷类似物进行抗病毒 治疗［１］，核苷类药物的耐药性和 ＩＦＮα的无应答一 直是当前抗病毒治疗的局限所在。寻找干预 ＨＢＶ感 染和复制的新靶点和新方法，最大限度的抑制 ＨＢＶ 复制，对阻止乙肝进程及并发症的发生具有重要意 义。绿茶的主要功能成分是茶多酚，以黄烷醇和黄酮 醇为主。儿茶素是绿茶中黄酮类的主要成分，其中以 表没 食 子 儿 茶 素 没 食 子 酸 酯 （ＥＧＣＧ）含 量 最 多［２］。 研究［３］表明 ＥＧＣＧ具有抗肿瘤细胞增殖、抗细胞氧 化、诱导细胞凋亡、抗菌等作用，且具有神经保护作 用。最新研究［４］发现，ＥＧＣＧ还具有抗病毒活性，如 能抗流感病毒、ＨＩＶ病毒、ＥＢ病毒、腺病毒等。ＥＧＣＧ 在体外可抑制乙肝病毒复制［５］，但其具体作用机制却
山东医药 ２０１８年第 ５８卷第 １５期
表没食子儿茶素没食子酸酯对乙肝病毒复制的 体外抑制作用及其机制
吴绍凤１（１青岛大学基础医学院，山东青岛 ２６６０２１；２青岛大学附属医院）
摘要：目的 观察表没食子儿茶素没食子酸酯（ＥＧＣＧ）对乙肝病毒复制的体外抑制作用，并探讨其机制。方法 取对数生长期 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞，分为 Ａ、Ｂ、Ｃ组。Ａ组、Ｂ组分别加入终浓度为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ，对照 组不作任何处理。培养 ２４ｈ收集细胞上清，检测各组乙肝病毒 ｅ抗原和 ｓ抗原，采用 ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ法检测各组乙 肝病毒 ＤＮＡ。取对数生长期 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞，接种于 ６ｃｍ培养皿，将细胞分为 １、２、３、４组。１、２组分别加入终浓 度为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ，３组加入 ２００ｎｍｏｌ／Ｌ的 Ｒａｐａｍｙｃｉｎ，４组不做任何处理，培养 ２４ｈ。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法检测各组细胞自噬标记蛋白 ＬＣ３Ⅱ ／Ⅰ、自噬降解相关蛋白 ｐ６２／βａｃｔｉｎ。取对数生长期 ＨｅｐＧ２．２．１５细 胞接种于 １２孔板，将细胞分为空白组、对照组、自噬抑制组（又分为 ３ＭＡ组和 ＣＱ组）。其中，对照组、３ＭＡ组、ＣＱ 组又各自分为 ２组。对照组分别加入终浓度为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ处理。３ＭＡ组和 ＣＱ组分别先用终浓度 为 １０ｍｍｏｌ／Ｌ的 ３ＭＡ和 ５０μｍｏｌ／Ｌ的 ＣＱ预处理半小时，再分别加入终浓度为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ。空白组 不作任何处理。２４ｈ后收集各组细胞上清，检测各组乙肝病毒 ｅ抗原、ｓ抗原和乙肝病毒 ＤＮＡ。结果 与 Ｃ组比 较，培养 ２４ｈ时 Ａ、Ｂ组乙肝病毒 ｅ抗原、ｓ抗原相对量及均乙肝病毒 ＤＮＡ的相对表达量降低（Ｐ均 ＜０．０１）。与 ４ 组比较，１、２、３组 ＬＣ３Ⅱ ／Ⅰ均升高，ｐ６２／βａｃｔｉｎ均降低（Ｐ均 ＜０．０１）。与对照组同浓度比较，１、２组乙肝病毒 ｅ抗 原、ｓ抗原相对量及 ＤＮＡ相对表达量均升高（Ｐ均 ＜０．０５）。结论 ＥＧＣＧ可体外抑制乙肝病毒的复制，其机制可 能为激活细胞自噬。 关键词：表没食子儿茶素没食子酸酯；乙肝病毒；自噬；细胞自噬 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２２６６Ｘ．２０１８．１５．０１１ 中图分类号：Ｒ３７３．２＋１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２２６６Ｘ（２０１８）１５００３９０４
鲜有 报 道。２０１６年 １０月 ～２０１７年 ７月，我 们 以 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞为模型，观察了 ＥＧＣＧ对 ＨＢＶ复制 的体外抑制作用，并探讨其作用机制。 １ 材料与方法 １．１ 细胞、ＥＧＣＧ、试剂及仪器 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞 系购自 ｉＣｅｌｌ生物公司。ＨｅｐＧ２．２．１５细胞给予含 １５％胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ公司）的 ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ公司）培 养基，置于 ５％的 ＣＯ２、３７℃饱和湿度的培养箱中培 养。ＥＧＣＧ（南通 飞 宇 生 物 科 技 有 限 公 司 ），根 据 我 们前期细胞毒性实验结果，８０μｍｏｌ／Ｌ以下 ＥＧＣＧ 对 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞的细胞毒性较小，因此，我们选 择 ４０、８０μｍｏｌ／Ｌ进行后续实验。
基金项目：山东省自然科学基金资助项目（ＢＳ２０１４ＹＹ０１５）；中国博士 后科学基金面上资助项目（２０１５Ｍ５７０７４）；中国博士后科学基金特别 资助项目（２０１６Ｔ９０６１２）。 通信作者：李宁（Ｅｍａｉｌ：ｎｉｎｇ９９＠１６３．ｃｏｍ）；侯琳（Ｅｍａｉｌ：ｑｉｎｇｙｉ００１ ＠１２６．ｃｏｍ）
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鼠抗 βａｃｔｉｎ、ｐ６２多克隆抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司）；聚 偏二氟 乙 烯 （ＰＶＤＦ）膜 （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公 司 ）；ＢＣＡ蛋 白 试 剂 盒 和 Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ公 司 ）； ６ｘＰｒｏｔｅｉｎｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ（北 京 全 式 金 生 物 有 限 公 司）。垂直 电 泳 仪、湿 法 转 膜 仪 （ＢｉｏＲａｄ公 司 ）；牛 血清白蛋白（ＢＳＡ）（索莱宝生物有限公司）。 １．２ ＥＧＣＧ对乙肝病毒抗原、ＤＮＡ的影响观察 １．２．１ ＨｅｐＧ２．２．１５细胞分组及 ＥＧＣＧ干预方法 取对数生长期 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞接种于 １２孔板，将 细胞分为样本（Ａ、Ｂ组）及对照组，每组 ５个复孔。 Ａ组、Ｂ组分别加入终浓 度 为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ，对照组不做任何处理。 １．２．２ 各组乙肝病毒抗原检测 培养 ２４ｈ后收集 细胞上清，用 ＰＢＳ稀释 １０倍，按照 ＥＬＩＳＡ试剂盒说 明书进行乙肝病毒 ｅ抗原和 ｓ抗原的检测。分别置 于酶标仪 ４９０、６３０ｎｍ波长处检测各孔的光密度 ＯＤ 值，按照公式计算乙肝病毒 ｅ抗原和 ｓ抗原的相对 表达量。抗原相对量 ＝［样本（ＯＤ４９０ －ＯＤ６３０）／空白 （ＯＤ４９０ －ＯＤ６３０）］×１００％。 １．２．３ 各组乙 肝 病 毒 ＤＮＡ检 测 采 用 ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ法。培养 ２４ｈ后收集细胞上清，用 Ｔａｋａｒａ公司 的迷 你 病 毒 ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 提 取 上 清 中 病 毒 ＤＮＡ。用预冷 的 ＰＢＳ洗 两 遍，裂 解 液 （５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴｒｉｓＨＣｌ，ＰＨ７．４，１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，１％ＮＰ４０）４℃旋 转裂解 １５ｍｉｎ，１４０００ｇ离心 １ｍｉｎ，取上清，再用细 胞 ＤＮＡ提取试剂盒按说明书提取细胞质中乙肝病 毒 ＤＮＡ，将 提 取 好 的 病 毒 ＤＮＡ 进 行 荧 光 定 量 ＰＣＲ［６］。细胞总 ＲＮＡ的提取，将同组细胞按照 ＴＲ Ｉｚｏｌ试剂盒说明书提取总 ＲＮＡ，取 １μｇ总 ＤＮＡ反 转录 为 ｃＤＮＡ，对 内 参 基 因 ＧＡＰＤＨ 进 行 ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ相对定量。荧光定量 ＰＣＲ反应条件为 ９４℃、 ３０ｓ，９４℃、５ｓ，６０℃、３０ｓ，４０个循环数。荧光定量 ＰＣＲ的 引 物 序 列 为 乙 肝 病 毒 上 游 引 物 序 列 ５′ ＴＣＴＣＴＧＣＡＡＴＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣ３′，下 游 引 物 ５′ＣＡ ＧＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣ３′；ＧＡＰＤＨ 上 游 引 物 序列 ５′ＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴ３′，下游引 物 ５′ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴ３′。细胞内、细 胞外乙肝病毒 ＤＮＡ的相对表达量以 ２－ΔΔＣｔ表示。 １．３ ＥＧＣＧ对自噬标记蛋白 ＬＣ３Ⅱ ／ＬＣ３Ⅰ、自噬 降解 相 关 蛋 白 ｐ６２／βａｃｔｉｎ的 影 响 观 察 采 用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ法。取对数生长期 ＨｅｐＧ２．２．１５细 胞接种于 ６ｃｍ培养皿中，将细胞分为 １、２、３、４。１、 ２组分别加入终浓度为 ４０和 ８０μｍｏｌ／Ｌ的 ＥＧＣＧ，Ｃ 组加入 ２００ｎｍｏｌ／Ｌ的 Ｒａｐａｍｙｃｉ
０．０２％ 胰 蛋 白 酶 消 化 液 （碧 云 天 生 物 有 限 公 司）；ＭＴＴ试剂盒（索莱宝生物公司）；青链霉素混合 液（碧云天生物有限公司）；反转录试剂盒 （Ｔａｋａｒａ 公司）；实时定量 ＰＣＲ试剂盒（北京全式金生物有限 公司）；ＨＢＶ抗原检测 ＥＬＩＳＡ试剂盒（上海科华生物 工程股份有限公司）；自噬抑制剂（氯喹 ＣＱ、３ＭＡ、 Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）和兔抗 ＬＣ３多克隆抗体（Ｓｉｇｍａ公司）；