浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖与分化的作用

《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research
文章编号:2095-4344(2019)21-03342-07
3342 www.
CRTER .org
·研究原著·
李小菊，硕士，主治医师。

通讯作者：宋光保，博士，主任医师，教授，广东省口腔医院特诊中心，广东省广州市 510280
文献标识码:A
稿件接受：2019-04-05
Li Xiaoju, Master, Attending physician, Department of Stomatology, the People’s Hospital of Longhua, Shenzhen 518109,
Guangdong Province, China
Corresponding author: Song Guangbao, MD, Chief physician, Professor, Center of Special Clinic, Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China
浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖与分化的作用
李小菊1，宋光保2，杨剑珍3，魏 波1，武 斌1(1深圳市龙华区人民医院口腔科，广东省深圳市 518109；2广东省口腔医院特诊中心，
广东省广州市 510280；3广东省口腔医院番禺分院牙体牙髓科，广东省广州市 510280) DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768 ORCID: 0000-0001-9438-2959(李小菊)
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文题释义：
浓缩生长因子：是第3代血小板浓缩萃取物质即浓缩生长因子，由于制备方法简单不添加任何物质，自体获取，不存在免疫排斥反应，其中含有高浓度生长因子，是一种理想的生物材料。

人牙龈成纤维细胞：是牙龈结缔组织中主体细胞，不仅具有活跃的自身更新能力和可以合成胶原纤维能力，而且具有一定的潜在成骨能力，在牙周组织的修复再生中起重要作用。

摘要
背景：血液中含有大量具有再生和修复功能的生长因子及血小板成分，对软硬组织再生具有促进作用。

目的：通过体外实验研究浓缩生长因子萃取液对人牙龈成纤维细胞增殖和成骨分化的影响。

通过临床体内试验研究浓缩生长因子在口腔种植中促进软硬组织再生的作用。

方法：选择深圳市龙华区人民医院口腔科就诊患者。

①体外实验：用离心法制取患者静脉血浓缩生长因子，分离培养人牙龈成纤维细胞；实验分4组：对照组采用完全培养基培养，其他3组于完全培养基中添加体积分数25%，50%，100%的浓缩生长因子萃取液培养；②体内试验：对患者患牙进行微创拔牙同时植入种植体，并放置浓缩生长因子用于诱导软硬组织的快速愈合，6个月后分别进行二期种植手术，采用改良信封瓣增加唇侧牙龈厚度及增加近远中软组织的量进行牙龈塑形3个月，获得与邻牙相协调的软组织轮廓。

结果与结论：①体外实验结果：CCK-8检测，半定量碱性磷酸酶活性测定，矿化颗粒量和成骨相关基因RT-PCR 检测显示，与对照组相比，培养3 d ，50%和100%浓缩生长因子萃取液组人牙龈成纤维细胞增殖能力显著增强，培养第14天体积分数100%浓缩生长因子萃取液组的碱性磷酸酶活性升高，矿化分子量明显增多，成骨基因RUNX2和骨钙素mRNA 的表达量升高；②体内试验结果：浓缩生长因子可以促进患者口腔种植体周围骨组织再生，与术后3个月对比，术后14个月种植体周围骨量显著增加，龈缘位置无明显退缩，龈乳头充盈牙间隙；③结果证实：浓缩生长因子萃取液可促进人牙龈成纤维细胞增殖与分化，可促进口腔种植体周围软硬组织再生。

关键词：
浓缩生长因子；浓缩生长因子萃取液；血小板；人牙龈成纤维细胞；增殖；分化；口腔种植；组织构建；软组织再生；骨组织再生
中图分类号：R452；R783 基金资助：
广东省医学科研基金(A2017540)，项目负责人：杨剑珍；深圳市卫生计生系统科研项目(SZFZ2018035)：项目负责人：李小菊
Effect of concentrated growth factors on proliferation and differentiation of human gingival fibroblasts
Li Xiaoju 1
, Song Guangbao 2
, Yang Jianzhen 3
, Wei Bo 1
, Wu Bin 1 (1
Department of Stomatology, the People’s Hospital of Longhua, Shenzhen 518109, Guangdong Province, China; 2Center of Special Clinic, Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China; 3Department of
Endodontics, Panyu Branch of Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou 510280, Guangdong Province, China)
Li XJ, Song GB, Yang JZ, Wei B, Wu B. Effect of concentrated growth factors on proliferation and differentiation of human gingival fibroblasts.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(21):3342-3348. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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Abstract
BACKGROUND: In the blood, there are a large number of growth factors and platelet components with regeneration and repair functions, which can promote the regeneration of soft and hard tissues.
OBJECTIVE: To study the effect of concentrated growth factor extract on the proliferation and osteogenic differentiation of human gingival fibroblasts and to explore the clinical application of concentrated growth factors in oral implantology.
METHODS: Patients admitted at the Department of Stomatology, People’s Hospital of Longhua, Shenz hen were selected. (1) In vitro
experiment: Concentrated growth factors were extracted by centrifugation, and human gingival fibroblasts were isolated and cultured. The cells were divided into four groups and cultured in complete culture media containing 0 (control), 25%, 50% and 100% concentrated growth factor extract). (2) In vivo experiment: The affected teeth were extracted followed by dental implantation. Concentrated growth factor was placed to induce the rapid healing of soft and hard tissues. Six months later, two-stage implantation was performed. The modified envelope flap was used to increase the thickness of the labial gingiva and the amount of soft tissue in the proximal and distal areas for 3 months to obtain soft tissue contours in coordination with the adjacent teeth.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment results: Compared with the control group, the proliferation of human gingival
fibroblasts was significantly increased by 50% and 100% concentrated growth factor extract on the 3rd day of culture. On the 14th day of culture, compared with the control group, the activity of alkaline phosphatase, the molecular weight of mineralization and the expression of
osteoblast-associated genes RUNX2 and osteocalcin were significantly increased in the 100% concentrated growth factor extract group. (2) In vivo experiment results: Concentrated growth factor extract could promote bone regeneration around oral implants. There was no obvious retraction at the gingival margin, and the gingival papilla filled the space of the teeth. The bone mass around the implant increased significantly at 14 months in relative to 3 months after implantation. To conclude, concentrated growth factor extract can promote the proliferation and osteogenic differentiation of human gingival fibroblasts and the peri-implant regeneration of soft and hard tissue.
Key words: concentrated growth factor; concentrated growth factor extract; platelets; human gingival fibroblasts; proliferation; differentiation; oral implantation; tissue construction; soft tissue regeneration; bone tissue regeneration
Funding: the Medical Science Research Foundation of Guangdong Province, No. A2017540 (to YJZ); the Shenzhen Municipal Health and Family Planning System Research Project, No. SZFZ2018035 (to LXJ)
0 引言 Introduction
牙周炎与慢性根尖周炎是导致牙缺失的常见原因[1]，种植修复是目前最常用的治疗牙缺失的方法之一。

在牙槽骨的缺损部位植入种植体后，种植窝的形状和大小与种植体形状和大小常不完全贴合，在种植体上方1/3区域，种植体与种植窝之间存在较大的楔状间隙，会影响种植成功率和缩短种植体的使用寿命。

引导骨再生技术或者植入骨材料是修复缺损的牙槽骨最常用方法[2-3]。

Saccol 在2006年提出浓缩生长因子，由于它含有各类高浓度的生长因子及纤维蛋白，对骨组织再生的功能具有明显促进作用，属于第3代血液制品[4-8]。

浓缩生长因子是一种新型修补生物材料，其含有各类高浓度生长因子和纤维蛋白成分，并具有改善和促进组织再生的独特性质，是再生医疗领域中的新材料和技术[9-10]。

目前浓缩生长因子在上颌窦提升及种植体周围骨缺损再生中得到广泛应用，可促进骨组织再生[11-14]。

尤其在前牙区种植修复中，不仅要恢复功能，更要关注过程及最终的修复效果。

近年来，浓缩生长因子在临床骨缺损种植方面得到广泛应用，显著提高种植成功率，扩大种植适应证，对修复效果及种植体周围软组织状态起到积极的作用。

这项研究目的是通过体外和临床试验来评估浓缩生长因子对牙槽骨组织缺损部分再生的促进作用，寻求口腔种植过程中种植体周围骨缺损修复的新方法和新材料。

浓缩生长因子作为新一代生物材料可促进种植体周围组织的再生尚缺乏足够临床证据，浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖与分化的促进作用及其在临床种植中的应用目前尚未见报道。

试验通过观察在即刻种植中应用浓缩生长因子后其种植体周围骨组织再生，探究浓缩生长因子对即刻种植的有利影响，为浓缩生长因子在口腔种植中的临床应用提供参考。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学实验、自身对照临床试验。

1.2 时间及地点 于2017年6月至2018年6月在深圳市龙华人民医院中心实验室完成。

1.3 材料
浓缩生长因子萃取液(体外实验)：来源于深圳市龙华区人民医院口腔科就诊3例健康(血压、血脂及血糖水平正常，无系统性疾病)男性患者，平均年龄26岁。

人牙龈组织(体外实验)：来源于人游离牙龈组织，供者为6名志愿者，来自深圳市龙华区人民医院口腔科，平均年龄12岁。

口腔种植临床病例(体内试验)：于深圳市龙华区人民医院口腔科就诊女性患者1例，43岁。

试验方案已经深圳市龙华区人民医院伦理委员会讨论批准。

实验在术前与患者进行充分沟通并取得患者同意，签署知情同意书。

1.4 方法 1.4.1 体外实验
人牙龈成纤维细胞体外分离培养：术前与患者及监护人进行充分沟通并取得同意，签署知情同意书。

在阻生牙拔出过程中取部分游离牙龈放于无菌PBS 中，将血渍冲洗干净，在超净工作台中，用无菌眼科剪剪成小块，用组织块法培养人牙龈成纤维细胞，将免疫组织化学角蛋白阴性和波形蛋白阳性的第4-10代细胞用于后续的实验。

浓缩生长因子萃取液的制备：在无菌条件下，抽取3例健康男性患者静脉血于5 mL 到真空管；静脉血经过变速离心后，分成3层结构：红细胞碎片位于最底层，浓缩生长因子凝胶位于中间层，乏细胞上清液位于最上层，见图1A 。

浓缩生长因子凝胶呈半透明胶冻状，质地坚韧且富有弹性，
李小菊，宋光保，杨剑珍，魏波，武斌. 浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖与分化的作用[J]. 中国组织工程研究，2019，23(21):3342-3348. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
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并且表面光滑，见图1B ；浓缩生长因子凝胶中的水分被挤出后，浓缩生长因子凝胶呈薄膜状结构，见图1C ；在DMEM 中加入浓缩生长因子膜，见图1D 。

将浓缩生长因子膜放置于预先盛有2 mL 的DMEM 培养基(Gibco ，美国)的孔板中，并将培养板放置于孵箱中孵育，7 d 后收集孔板中的培养液，离心，经无菌滤器过滤除菌，获得浓缩生长因子萃取液。

定义最初收集的浓缩生长因子萃取液的体积分数为100%。

实验进一步用DMEM 培养基稀释以获得3组体积分数分别为25%，50%和100%的浓缩生长因子萃取液。

实验分组：在CCK-8试剂(同仁株式会社，日本)检测人牙龈成纤维细胞的增殖能力，半定量检测碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，中国)活性和成骨相关基因RT-PCR 表达中，实验分为4组：对照组(0%浓缩生长因子萃取液)，25%，50%和100%浓缩生长因子萃取液组。

矿化颗粒量实验中分为2组：对照组为成骨诱导培养基(mineral induction medium ，MM)，在DMEM 完全培养基中加入50 mg/L 抗坏血酸(Sigma ，美国)和10 mmol/L β-甘油磷酸钠(Sigma ，美国)；实验组为MM+100%浓缩生长因子萃取液。

而在X 射线检测临床口腔种植体周围骨再生试验中，用患者术前与术后进行对照。

每组实验重复3次。

不同浓度浓缩生长因子萃取液对人牙龈成纤维细胞增殖的影响：将人牙龈成纤维细胞以5×107 L -1接种到含体积分数10%胎牛血清(PAA ，奥地利)完全培养基的96孔板，每组设置6个复孔，加入50 μL 不同浓度的浓缩生长因子萃取液(对照组、25%，50%，100%浓缩生长因子萃取液组)，分别孵育1，2，3 d ，使用CCK-8测定细胞增殖。

在培养板的每个小孔中添加10 μL 的CCK-8试剂，经过90 min 的培养后，在酶标仪的紫外线波长450 nm 处检测吸光度值。

不同浓度浓缩生长因子萃取液对人牙龈成纤维细胞分化的影响：将培养1个月的细胞浓度为5×107 L -1的细胞悬液添加到24孔板中，每组设置3个复孔。

添加100 μL 不同体积分数25%，50%，100%的浓缩生长因子萃取液到24孔板中。

在浓缩生长因子萃取液加入后的第7，14天检测碱性磷酸酶活性，每隔3 d 更换培养基和浓缩生长因子萃取液。

干预第7，14天，在24孔板中的每孔中加入细胞裂解液200 μL ，并充分震荡10 min 使细胞裂解，然后加入500 μL
PBS 和500 μL 基质液，空白对照孔中则加入200 μL 双蒸水、缓冲液和基质液各500 μL 。

混和均匀后，在37 ℃水浴中水浴15 min ，在每组的24空板的每孔中加入1.5 mL 显色剂，以空白管作为调零孔，并在酶标仪的波长为450 nm 处检测的吸光度值。

钙结节茜素红染色：将培养1个月的人牙龈成纤维细胞以5×107 L -1细胞浓度接种于6孔板中，共接种2板，分为实验组和对照组，每组设置3个复孔，1 d 后对照组用MM 培养，实验组为MM+100%浓缩生长因子萃取液。

以后每隔2 d 换1次液。

每日光学显微镜下观察，在培养21 d 后，待有无定形物质形成时再进行茜素红染色(赛业，中国)。

取出培养板去除培养液，用PBS 冲洗3次，然后用体积分数95%乙醇固定20 min 后，再用双蒸水洗3次，最后加入适量茜素红染液(体积分数0.1%)，在37 ℃培养箱里培育30 min ，双蒸水洗3次，显微镜下观察并拍照。

RT-PCR 方法检测成骨相关基因的表达：将培养1个月的人牙龈成纤维细胞以细胞浓度为5×108 L -1的细胞悬液接种于10 cm 培养板中，共6个培养皿。

对照组为MM ，实验组为成骨诱导培养基加MM+(体积分数25%，50%，100%)浓缩生长因子萃取液。

分别在第3，7，14天3个时间点用Trizol(Invitrogen ，美国)法提取RNA 并反转录为cDNA ，并采用RT-PCR 试剂盒(TakaRa ，日本)的进行扩增，随后采用实时定量PCR 测定成骨相关基因RUNX2和骨钙素的表达，内参基因设为β-Actin 。

实验所用的检测成骨相关基因表达的引物设计如表1所列[9]。

1.4.2 体内试验 体外实验所用浓缩生长因子是异体，临床种植试验所用浓缩生长因子是自体。

考虑到自体浓缩生长因子与异体浓缩生长因子具有相同的主要成分，使用自体或异体浓缩生长因子不会影响实验结果。

患者术前使用氯己定含漱3 min ，共3次，经常规消毒铺巾，必兰局麻下进行角行瓣设计，翻瓣后微创拔除患牙，搔刮拔牙窝，清理残余肉芽组织，并用大号球钻清理拔牙窝内感染的骨壁，庆大霉素和甲硝唑冲洗拔牙窝，球钻定位，在拔牙窝的腭侧壁通过将来修复体的舌隆突的位点上定位，先锋钻及扩孔钻逐级扩孔，植入Zimmer(Φ3.7 mm× 13.0 mm)，植入扭矩30 Ncm ，旋入覆盖螺丝；使用骨刮刀在根尖部位刮取自体骨放置在种植体唇侧暴露的部位用
人游离牙龈组织块法培养
细胞来源： 深圳市龙华区人民医院口腔科就诊的平均年龄12岁的6名志愿者游离牙龈组织
培养基介绍： DMEM 培养基(Gibco ，美国)；胎牛血清(PAA ，奥地利) 添加材料： 链霉素(Sigma ，美国)、青霉素(Sigma ，美国) 培养时间： 1个月 传代情况： 4-14代
细胞鉴定：
免疫组织化学染色检测角蛋白阴性和波形蛋白阳性
表1 检测成骨相关基因RT-PCR 的引物设计
Table 1 Primer sequences of osteoblast-associated genes used in
Li XJ, Song GB, Yang JZ, Wei B, Wu B. Effect of concentrated growth factors on proliferation and differentiation of human gingival fibroblasts.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(21):3342-3348. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768
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于骨诱导，在外层填入Bio-Oss 骨粉与浓缩生长因子的混合物，然后放置浓缩生长因子膜，减张缝合。

术后拍摄锥形束CT 验证种植体植入的位置，术后3，8，14个月复查及X 射线检测种植体周围牙槽骨附着水平，龈缘位置，龈乳头形态，并与术前进行对比。

1.5 主要观察指标 人牙龈成纤维细胞增殖与分化及口腔种植体周围软硬组织形态。

1.6 统计学分析 计量资料数据均用x _
±s 表示，应用SPSS 17.0统计学软件进行相关的统计分析，组间比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 受试者数量分析 参与试验的患者均进入结果分析，中途无退出者。

2.2 各组CCK-8法检测人牙龈成纤维细胞增殖变化 实验第1天，100%浓缩生长因子萃取液组与对照组相比，人牙龈成纤维细胞增殖的效果显著(P < 0.05)。

在实验第2，3天，与对照组相比，50%浓缩生长因子萃取液组增殖的效果显著(P < 0.05)，100%浓缩生长因子萃取液组数值显著增加(P < 0.01)；而25%浓缩生长因子萃取液组与对照组相比，人牙龈成纤维细胞增殖的促进效果不显著(P > 0.05)，见图2。

2.3 各组碱性磷酸酶活性变化 经过7，14天的培养，与对照组相比，100%浓缩生长因子萃取液组碱性磷酸酶活性显著升高(P < 0.01)，同时50%浓缩生长因子萃取液组在这2个时间点与对照组相比碱性磷酸酶活性均升高(P < 0.05)，见图3。

2.4 成骨诱导培养基培养 在干预培养21 d 后，两组细胞在显微镜下均可见无定形物质(显微镜：IX73，Olympus Corporation ，Tokyo ，Japan)。

并且经过茜素红染色后，这些无定形物质均呈深红色结节状，形态多种多样，并且100%浓缩生长因子萃取液组比对照组形成更多的钙结节，见图4，这进一步说明浓缩生长因子萃取液能够促进人牙龈成纤维细胞的成骨分化。

2.5 各组成骨相关基因表达 在干预培养第3，7，14天，对成骨相关基因RUNX2和骨钙素的表达进行RT-PCR 检测，结果见图5，6。

在干预培养第3，7，14天，与对照组相比，25%与50%浓缩生长因子萃取液组中RUNX2表达量升高(P < 0.05)；100%浓缩生长因子萃取液组中RUNX2表达量显著增高(P < 0.01)。

在干预培养第7，14天，与对照组相比，25%，50%浓缩生长因子萃取液组中骨钙素表达量增加(P < 0.05)，100%浓缩生长因子萃取液组中骨钙素表达量有显著增高(P < 0.01)。

实验结果表明浓缩生长因子萃取液能够显著上调成骨相关基因RUNX2和骨钙素的表达。

2.6 口腔种植形态 上颌左侧中切牙即刻种植并同期置
入浓缩生长因子膜后，软组织愈合良好，通过暂冠塑形获得比较满意的穿龈轮廓，戴入永久冠后牙龈轮廓和形态得到较好的维持，龈缘无明显退缩，龈乳头获得较好的充盈。

X 射线影像片检查显示种植体形成了良好的骨整合，术后14个月与术后3个月对比，种植体周围骨量增加，见图7。

3 讨论 Discussion
浓缩生长因子作为新一代生物材料在骨引导再生技术中起重要作用。

骨引导再生技术在牙槽骨缺损种植方面已经得到广泛应用[2
，15]
，可以显著提高口腔种植成功率，扩
大口腔种植的适应证，对修复效果及种植体周围软组织再生起到积极的促进作用[16-17]。

最新研究表明富血小板血浆与富血小板纤维蛋白具有促进骨组织再生、减轻术后反应、抗感染及炎症调节等作用[18-22]。

浓缩生长因子是第3代血小板浓缩物制品，是最新一代自体浓缩生长因子。

浓缩生长因子可以由静脉血变速离心获取，并且在其制备过程中无需添加任何化学制剂，具有优良的生物相容性，不会引起免疫反应。

浓缩生长因子富含各类高浓度的生长因子及纤维蛋 白[23]，在变速离心制备浓缩生长因子的过程中使得血小板被激活，释放出各种生长因子，主要包括胰岛素生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、转移生长因子和成纤维细胞生长因子等，这些生长因子具有促进细胞增殖、基质合成、成骨分化和血管生成的作 用[12-14]。

进一步的，浓缩生长因子所具备的纤维网状支架结构又能为生长因子所诱导生成的新生组织提供富足的生长空间结构。

实验结果表明，浓缩生长因子萃取液在人牙龈成纤维细胞的增殖和分化中起重要作用。

浓缩生长因子萃取液具有明显促进人牙龈成纤维细胞增殖和分化作用，并且具有剂量依赖性，在使用100%浓缩生长因子萃取液时，碱性磷酸酶活性最强。

通过碱性磷酸酶定量实验发现，与对照组相比，100%浓缩生长因子萃取液组中的碱性磷酸酶活性更强，实验组表现为染色更深、更均匀，这充分证明了浓缩生长因子能够提高人牙龈成纤维细胞内的碱性磷酸酶的表达水平。

在有浓缩生长因子萃取液存在情况下，人牙龈成纤维细胞在成骨诱导的培养基中能够产生更多的钙结节，而碱性磷酸酶活性和钙结节形成是成骨细胞分化成熟的标志，说明浓缩生长因子萃取液可促进人牙龈成纤维细胞向成熟的成骨细胞分化。

通过RT-PCR 对成骨相关基因RUNX2和骨钙素的检测发现，在实验的第7，14天，实验组中RUNX2和骨钙素成骨相关基因的表达量均高于对照组，也充分地证明了浓缩生长因子可以上调成骨相关基因的表达，从而促进人牙龈成纤维细胞的成骨分化。

通过临床试验证实了浓缩生长因子对牙槽骨组织的愈合有促进作用，并长期维持在稳定水平，与之前的相关报道相符[24-25]。

在临床试验中，观察到患者上颌左侧中切牙
李小菊，宋光保，杨剑珍，魏波，武斌. 浓缩生长因子对人牙龈成纤维细胞增殖与分化的作用[J]. 中国组织工程研究，2019，23(21):3342-3348. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768
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图注：图A 为血液被分为3层；B 为分离浓缩生长因子凝胶；C 为纤维蛋白凝胶压制的膜；D 为纤维蛋白凝胶膜放置于培养基中。

图1 浓缩生长因子萃取液制备 Figure 1 Preparation of
concentrated growth factor extract
图注：与对照组比，
a P < 0.05，
b P < 0.01。

CGFe ：浓缩生长因子萃取液。

图2 CCK-8法检测各组人牙龈成纤维细胞增殖变化
Figure 2
Cell counting kit-8 detection of the proliferation of human gingival fibroblasts
图注：与对照组比，a P < 0.05，b P < 0.01。

CGFe ：浓缩生长因子萃取液。

图3 各组碱性磷酸酶活性变化
Figure 3 Alkaline phosphatase activity
图注：图A 为对照组形成矿化结节；B 为100%浓缩生长因子萃取液组形成矿化结节。

成骨诱导21 d 后，经茜素红染色100%浓缩生长因子萃取液组矿化结节数明显多于对照组。

图4 各组矿化结节数量变化(茜素红染色，×40) Figure 4 Number of mineralized nodules (×40)
图注：与对照组比，a P < 0.05，b P < 0.01。

CGFe ：浓缩生长因子萃
取液。

图5 浓缩生长因子萃取液对成骨相关基因RUNX2 mRNA 表达水平的影响
Figure 5 Expression of RUNX2 mRNA after intervention with
concentrated growth factor extract
图注：与对照组比，a P < 0.05，b P < 0.01。

CGFe ：浓缩生长因子萃
取液。

图6 浓缩生长因子萃取液对成骨相关基因骨钙素 mRNA 表达水平的影响
Figure 6 Expression of osteocalcin mRNA after intervention with concentrated growth factor extract
3 d 7 d 1
4 d
干预培养时间
R U N X 2 m R N A 相对表达量 (R U N X 2/β-a c t i n )
对照组
骨钙蛋白m R
N A 相对表达量 (骨钙蛋白/β-a c t i n )
3 d 7 d 1
4 d
干预培养时间
对照组
7 d 14 d
干预培养时间
碱性磷酸酶活性(吸光度值)
1 d
2 d
3 d
干预培养时间
吸光度值
a
a
a
b
b 对照组
25%CGFe 组 50%CGFe 组 100%CGFe 组
Li XJ, Song GB, Yang JZ, Wei B, Wu B. Effect of concentrated growth factors on proliferation and differentiation of human gingival fibroblasts.
Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2019;23(21):3342-3348. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.1768
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即刻种植并同期置入浓缩生长因子膜后软组织愈合良好。

通过暂冠塑形获得比较满意的穿龈轮廓，戴入永久冠后牙龈轮廓和形态得到较好的维持，龈缘无明显退缩，龈乳头获得较好的充盈。

X 射线检查显示种植体形成了良好的骨整合，牙槽骨长期维持在稳定的水平。

实验总结出浓缩生长因子萃取液可以促进人牙龈成纤维细胞的体外增殖及成骨分化，并与人牙龈成纤维细胞具有良好的生物相容性[26]。

实验分离培养并鉴定人牙龈成纤维细胞，初步研究了浓缩生长因子萃取液在体外对人牙龈成纤维细胞增殖分化的影响。

浓缩生长因子具备特殊的三维立体结构和生物学特性，能够很好地满足组织工程支架材料的要求，且在的动物实验中已经证实浓缩生长因子具有促进新骨形成的作用[27-30]，因此浓缩生长因子可作为理想的骨组织工程支架材料。

随后的临床试验也证实了浓缩生长因子对牙槽骨组织的愈合有促进作用，可以加速种植体周围骨组织再生，增强种植体稳定性和延长种植体的使用寿命。

浓缩生长因子在临床种植中的作用已经有一些报 导[31-32]，未来工作可以考虑更多的临床病例研究，报道对照病例，进一步说明浓缩生长因子膜的优势。

致谢：感谢吉林大学及南方医科大学提供先进的科研平台，感谢南方医科大学宋光宝教授给予此次研究的指导与帮助。

作者贡献：李小菊进行实验设计、实施及评估。

资料收集为杨剑珍，魏波及武斌。

经费支持：该文章接受了“广东省医学科研基金(A2017540)；深圳市卫生计生系统科研项目(SZFZ2018035)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者共同认为不存在利益冲突。

机构伦理问题：试验方案已经深圳市龙华区人民医院伦理委员会讨论批准，经患者和相关家属知情同意，并签署知情同意书。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超
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图7 典型病例
Figure 7 A typical case
图注：深圳市龙华区人民医院口腔种植患者，女，43岁，诊断：根尖周炎。

图A 为术前锥形束CT 矢状观；B 为翻瓣后暴露牙根；C 为拔除牙根后牙合面观；D 为使用骨刮刀刮取自体骨泥覆盖在暴露的种植体表面；E 为将浓缩生长因子与红细胞分离；F 为浓缩生长因子与Bio-Oss 混合；G 为覆盖双层胶原膜，减张缝合；H 为术后锥形束CT 矢状观；I 为术后3个月，将临时冠拆除；J 为健康的牙龈过渡带；K 为正面咬合照；L 为左侧口内咬合照；M 为术后3个月根尖X 射线片；N 为术后8个月根尖X 射线片；O 为术后14个月根尖X 射线片。

图中全部箭头指向病变部位。

O
N M。