SMO在小鼠视觉传导通路发育过程中的表达

收稿日期!!""#$"%$!&基金项目!
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作者简介!郝彦利
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’K*在小鼠视觉传导通路发育过程中的表达
郝彦利B !洪乐鹏B !陈新安!!董为人E "B 广州医学院解剖教研室!广东广州&B"BI!#!香港中文大学解剖教研室!香港#E 南方医科大学组织胚胎学教研室!广东广州&B"&B&$
摘要!目的观察膜蛋白’K**,6-8-.!’K*"在胚胎第BEOB&天!JBEOJB&"小鼠视觉传导通路和生长锥中的表达%方法利用震荡切片机制备JBEOJB&小鼠头部水平和纵切片#并行视网膜组织培养%经荧光免疫组织化学染色后#激光扫描共聚焦显微镜观察%结果在JBE 和JB%的视网膜和视盘中#’K*有微弱表达&而在中脑及进入中脑并刚刚形成视束的视神经纤维中#’K*P 于JBE 强烈表达#且以中线为中轴呈倒Q 字形#但该表达方式于JB%消失#仅在视束的表浅区域和视网膜片断培养的轴突和生长锥中表达%结论’K*可能在引导视神经生长方面发挥一定作用%关键词!’K*&视觉传导通路&发育
中图分类号!2E!HN%I#////////文献标识码!R 文章编号!B#CE$%!&%!!""C ""B
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在小鼠的发育过程中#自一侧视网膜神经发出的神经纤维在胚胎第BE 天!JBE "开始投射至对侧的视束’B$E (%JB%时大部分视神经纤维投射至对侧的视束#一部分视神经纤维投射至同侧的视束%这部分视神经纤维只存在短暂的时间#随着机体的发育#在小鼠出生前消失’!(%在JB&#更多的视神经纤维投射至对侧的视束#并一直存在%在JBE 和JB%是小鼠视网膜节细胞产生和增殖的主要时期
’%(
#它们发出视神经纤
维#进入间脑#从而形成视觉传导通路#传导视觉信号%因此#JBEOJB&是小鼠视交叉发育的关键时期%引导视交叉发育的详细机制目前还不十分明了#有许多因子介入这个过程%本研究中我们将观察膜蛋白
’K**,6-8-.!’K*"从JBE 至JB&在视交叉发育过程
中的表达情况#以进一步了解引导视交叉发育的分子生物学机制%
BPP 材料和方法
BNBPP 动物和组织的准备
所有实验步骤均通过香港中文大学动物伦理委员会的认可%9&C 小鼠来自香港中文大学动物房%发现受精栓的日期界定为胚胎第"天!J""%以颈椎横断方法处死母鼠#取出胚胎后#将胚胎的头部截下#放入新鲜配置的%a 多聚甲醛溶液中#%/!保存%小鼠胚胎的头部包埋在凝胶蛋白与戊二醛的混合物中#以震荡切片机制备为B""/!K 水平切片或纵切片%
BN!//视网膜组织的培养
在倒置手术显微镜下#将JB%小鼠胚胎的头部取出#置于在XFJFD\$B!!)=/CN%")%/!的溶液中#并在此溶液中取出JB%胚胎的眼睛%将眼睛转至%/!)含Bb 小牛血清的XFJFD\$B!溶液中%用手术镊将视网膜剥出#并用!C 号针头将其切成"NE/KK 碎片%将视网膜组织片段移至铺有一层多聚赖氨酸的盖玻片上#加入含Bb 小牛血清XFJFD\$B!的培养液中#在全氧的EC/!培养箱中培养!%/6后#将培养液吸出#加以%b 多聚甲醛固定#%/!保存%
BNE//
荧光免疫组织化学染色
图!""#$%的表达
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&’"(%)*+%’,-."/01,*%’/2"30-4"#$%"056)0//*%’7*/"80,01,08"*’",(0"%6,*1"8*/1"-’8"60)*6(0)-.")0,*’-"-,"9!:";<=>7-/7/(%3’7@7A7-’87!)0/601,*B0.@C7<,7,(07/-$07,*$0>7,(07.0’/7*/7)0/6%’/*B07,%7#$%7/,-*’*’DC7#*$*.-)7)0/E.,/7-)07/(%3’7*’79!F7GH=C7956)0//*%’7%I7#$%7*/7I%E’87*’7-’7*’B0),087JK/(-607-))-@7*’7,(071-E8-.7)0D*%’/7%I7,(0K8*0’106(-.%’7;L=C7M7*/7,(07(*D(0)7$-D’*I*1-,*%’7%I7LC 77A7/(%3/7,(071(*-/$7056)0//*’D7#$%7%?B*%E/.@7-’87/%.*87-))%3/7*’7M7*’8*1-,07,(07-5%’/76)%N01,*’DO*’,%7,(07%6,*17,)-1,C 7#$%7*$$E’%/,-*’*’D7*/780,01,087-,7B0)@7/E60)I*1*-.7)0D*%’7%I7,(07%6,*17,)-1,7*’7,(07I)%’,-.7/01,*%’/7%’79!F7;9=C7M%,,087.*’0/70’1.%/07,(07056)0//*%’7)0D*%’7*’7L7-’87MC7&’79>7,(078%,,087.*’0/70’1.%/07,(07%6,*17,)-1,7-’87-))%376%*’,/7-,7,(07)0D*%’7056)0//*’D7#$%C 7P(07)%/,)-.7/*807*/7%’7,(07,%6705106,7I%)79>7*’73(*1(7,(078%)/-.7/*807*/7%’7,(07,%6C7P(07$*8.*’07*/7%’7,(07.0I,7*’7<7-’87HC7&’7L>7(%..%37-))%376%*’,/7-,7,(07$*8.*’0C7#1-.07?-)7*’7<>7H>7L7-’8797*/7QRR7!$>7-’87!RR7!$7*’7M7-’87SC
<H
L
M 9
切片和视网膜组织在含有!T 正常驴血清的RC!"$%.UV7WH#中孵育!7(后!加入一抗"抗#$%#&DX !!!!RR !#-’,-7L)E+7H*%,01(’%.%D@$!F7"过夜%洗涤后再加入与L@:K 结合的二抗#!!!RR !Y-14/%’7V-?%)-,%)*0/!Z9![C#C<C &%对照组除不加一抗!其余步骤相同!在
对照组中没有明显的染色%所有切片和组织的染色以
RC!7$%.UV7WH#盖片!以连接激光扫描共聚焦显微镜
’Z\L]RR !H*%K\-8!^0),I%)8![C_C &观察!波长为
‘!FU‘‘RO’$%
QOO 结果
QC!O#$%在视网膜中的表达
在未加一抗的对照组中没有明显的染色%在
9!:!#$%O 均匀而一致地表达在视盘#图!<&%在视网膜中!#$%表达由内向外呈辐射状!并且有一定的区
域性分布!越靠近视网膜的角部!表达越强烈%在距离视盘较近的地方!#$%表达较微弱%需要注意的是!
#$%不仅表达在视网膜上!而且在眼的血管和晶体中也有强烈的阳性表达%在9!F !#$%在视网膜表达方式#图!H &同9!:%在9!‘!无论在视盘和视网膜组织中!均未观察到#$%O 阳性染色%
QCQOO#$%在间脑和视网膜片段中的表达
在9!:的水平切片上!观察到#$%明显地表达在视神经纤维和间脑中#图!L 和!M &%#$%表达在间脑细胞中!并以中线为中心!呈倒J 字形状%#$%O 不仅明显表达在中线附近的间脑细胞中!而且在形成视束的神经纤维中也可看到#$%的显著表达%在
9!F 的纵切片中!可观察到在视束的边缘部位有微弱
的#$%表达#图!9&%在9!‘的水平切片和纵切片中均未观察到#$%表达%
视网膜组织片段在铺有多聚赖氨酸的盖玻片上!辐射状地发出神经轴突!其中a‘T 的神经轴突不断地再发出新的节段!继续向外生长%神经轴突的顶端为处于不同生长状态的生长锥%我们可观察到#$%明显地表达在神经轴突以及生长锥的主体和伪足中%在生长锥刚刚发出时#图Q<&!在生长比较强壮的生长锥中#图QH &!在有将要崩溃死亡预兆的生长锥中
#图QL &!在已经崩溃死亡的生长锥中#图QM &!均可以观察到表达强烈的#$%%
:OO 讨论
#$%是一个与X 蛋白耦连的膜蛋白!在^08D0(%D 家族传导通路中发挥着关键的作用%^08D0(%D #^(&所有成员的受体均为膜蛋白W-,1(08#W,1&%当W,1
未
图!""#$%在视神经生长锥的主干和伪足中的表达
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7(.1-"./01,1/".251*+52./785/8,1(.9:;
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与AB 结合时!#$%的活性被C3=抑制"一旦AB 与C3=相结合!#$%"立即被激活!从而进一步激活细胞
内的下游基因!如0D2);"蛋白和=D+53D2蛋白#E $"胚胎发育期间!A);4)B%4在引导器官形成中发挥了重要的作用!如中枢神经系统!四肢和肺的发育#FG"H $"因此对于#$%功能的研究与AB 有着密切的联系"AB 协同-)3,5-I?对跨越中线的神经轴索有吸引作用!在此之中#$%发挥了非常重要的作用#@$"
JD 等#K $研究表明!#$%的表达能够促进视网膜节细胞的增殖"在对果蝇的研究中!/1,14D,等#?L $发现C3=I#$%传导通路影响果蝇视盘中细胞的增殖!从而进一步影响视盘的发育"同时研究表明!抑制#$%的
功能会加重视盘发育的畸形"在!"基因缺陷的小鼠中容易有单眼的形成"在这个过程中!#$%发挥了重要的作用"此外!MD22)99等#??$研究表明!在斑马鱼中
#$%可通过影响视网膜神经细胞的增殖和凋亡来调控视觉眼的发育"AB 通过调控N1O 的活性来控制视
神经和视网膜的形成过程!其中#$%发挥了关键的作用#?!$"本研究中我们发现#$%表达在视网膜中!而且随着区域的变化!#$%呈不同的表达方式"#$%在视网膜角部表达比较集中!而这个区域是视源性神经干细胞产生的主要区域"同时!在眼的血管和晶体中!也能发现#$%的阳性表达"在P?E !在眼部的任何部位!均未观察到#$%的阳性表达"需要指出的是!
P?QRP?S 是视网膜节细胞产生和增殖的关键阶段!而P?E 时!大部分视网膜节细胞则发育成熟#S $"#$%随
着胚胎发育时间的不同有着不同的表达方式!说明
#$%在视网膜的发育过程中发挥着一定的作用!而
这需要进一步研究"
既往研究表明!#$%不仅影响眼的发育!还影响视神经的投射"N1,41等#?Q $对斑马鱼的研究发现!#$%基因缺陷的小鼠中没有正常视交叉形成%在#$%基
因缺陷小鼠中!应该越过中线的视神经纤维不能跨过中线而沿着中线延伸!投射到同侧的丘脑"6B)-等#S $的研究也证明了这一点"本研究中!我们观察在视交叉发育的关键阶段!P?QRP?E 中#$%的表达!结果发现在不同的时期!#$%有不同的表达方式"P?Q 是视交叉形成的最初时期!在此期间!#$%在间脑中呈倒
N 字表达!这种表达方式同67SST 特定期胚胎蛋白
原I?&##P&I?’细胞的表达很相似"67SST##P&I?是一群早期分化的细胞!同时表达67SS 和##P&I?!故称这些细胞为67SST##P&I?细胞"67SST##P&I?细胞在间脑中呈倒N 形排列!投射至对侧视束的视神经纤维直接穿过这些细胞占有的区域!而大多数投射至同侧的视神经纤维却沿着这些细胞的界限!转弯而投射至同侧视束"所以!在某些程度上来说!这些细胞界定了视交叉的界限#?E $"U5-V 等#?F $用67SS 的抗体干扰67SS 的功能!结果发现在P?Q 时跨越中线的视神经纤维明显减少"因此!#$%在P?Q 的表达方式提示其在引导视神经发育的方向和界定视交叉的区域方面可能有一定作用"随着胚胎的发育!在P?S 的间脑中并未观察到#$%的表达!仅在视束的表层发现有
#$%的微弱表达"在P?S 的视束中!新生的生长锥一般都位于比较表浅的位置!提示#$%在视觉系统发
育的过程中可能有引导生长锥生长的作用"在P?S 的视网膜片段培养中的生长锥和轴突中有#$%的表达也提示了这一点"在P?E 的视网膜和腹侧间脑中均未观察到#$%的表达!提示随着胚胎的发育!#$%引导轴突生长的作用可能会慢慢减弱!但需进一步研究证实"目前为止!#$%在引导视神经发育中所发挥的作用还不明了!需进一步的深入研究"参考文献!
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