慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制

慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增
殖的分子机制
曹稳珑;韦尉元;罗文;张笑石;严林海;谢玉波;肖强
【摘要】目的探索E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制.方法用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为实验组(LV-E2F-1-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为阴性对照组(LV-GFP组);空白对照组常规培养,不做任何处理.用RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因的表达.结果与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-E2F-1-GFP组人胃癌MGC-803细胞Skp2、Bcl-2和survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P＜0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P＜0.05).结论慢病毒介导E2F-1基因过表达可能通过降低Skp2、survivin、Bcl-2 基因表达和上调Bax基因表达来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2014(034)004
【总页数】5页(P459-463)
【关键词】胃癌;MGC-803细胞;E2F-1;过表达
【作者】曹稳珑;韦尉元;罗文;张笑石;严林海;谢玉波;肖强
【作者单位】广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院
胃肠腺体外科,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科,广西南
宁530021;广西医科大学第一附属医院胃肠腺体外科,广西南宁530021;广西医科
大学第一附属医院麻醉科,广西南宁530021;广西医科大学第一附属医院胃肠腺体
外科,广西南宁530021
【正文语种】中文
【中图分类】R735.2
在我国，胃癌的发病率及病死率均位居所有恶性肿瘤首位，每年因胃癌死亡人数约占全球胃癌病死总人数的1/4[1]。

恶性肿瘤的发生发展过程涉及多基因多因素的
相互作用，其中细胞凋亡的信号传导通路失调与肿瘤的侵袭、生长的关系最为密切。

E2F-1作为细胞转录的重要调节因子和众多基因转录的启动子, 前期的体内外实验
证实E2F-1对肿瘤的生长具有抑制作用[2-3]，但机制尚不十分明确。

因此本实验
通过重组慢病毒颗粒介导E2F-1基因过表达转染人胃癌MGC-803细胞，观察对
凋亡相关基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表达的影响，初步探讨E2F-1过表
达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制。

1.1 材料
含E2F-1基因过表达的重组慢病毒颗粒(Genechem公司)。

兔抗人一抗HA抗体(Santa Cruz公司)，羊抗兔二抗IgG抗体(Pierce公司)。

人胃癌MGC-803(中国
科学院上海细胞库)。

Trizol试剂(Invitrogen公司)，反转录试剂盒(中国上海生工
生物公司)。

细胞培养基RPMI1640及胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 方法
1.2.1 细胞培养与基因转染：人胃癌MGC-803细胞用含10%(体积分数)胎牛血清DMEM培养液培养，在37 ℃、5%(体积分数) 的CO2培养箱中培养。

隔天细胞
换液。

取对数生长期细胞接种于6孔板中，3.5×104个/孔，用不含抗生素的10%
DMEM培养液培养，观察待细胞汇合度达40%～60%时，按慢病毒转染说明书操作，以E2F-1基因过表达重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)和对照慢病毒颗粒(LV-GFP)分别感染人胃癌MGC-803细胞，作为实验组(LV-E2F-1-GFP组)和阴性对照组(LV-GFP组)，空白对照组细胞不做任何处理，常规培养。

待细胞长满孔板，常
规消化收集细胞样本，进入下一步实验。

1.2.2 RT-PCR检测人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA的表达：用Trizol法提取各组细胞的总RNA，按反转录试
剂盒说明反转录获取cDNA， PCR 仪扩增。

E2F-1 上游引物：5′-CCCAACTCCCTCTACCCT-3′,下游引物：5′-CTCCCATCTCATATCCATCCTG-3′，长度217 bp, 退火温度54 ℃；Skp2上游引物：5′-GCTGCTAAAGGT CTCTGGTGT-3′,下游引物：5′-AGGCTTAGATTCTGC AACTTG-3′，长度291 bp,退火温度60 ℃；Bax上游引物：5′-CCAAGAAGCTGAGCGAGTGT-3′,下游引物：5′-CCGGAGGAAGTCCAATGTC-3′;长度269 bp,退火温度55 ℃；Bcl-2上游引物：5′-GACTTCGCCGA GATGTCCAG-3′,下游引物：5′-CATCCCAGCCTCCGT TATCC-3′，长度259 bp,退火温度62 ℃；survivin上游引物：5′-AAATGCACTCCAGCCTCTGT-3′，下游引物：5′-TGTCGAGGAAGCTTTCAGGT-3′，长度为311 bp，退火温度60 ℃；内参GAPDH上游引物：5′-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCACCACCCT GTTGCTGTA-3′，长度为450 bp，退火温度52 ℃。

反应条件：94 ℃预变性4 min；30个循环，94 ℃ 30 s,52～62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s；72 ℃延伸5 min。

取3 μL PCR产物经2%非变性
琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像获取图片经Quantity One 软件分析，对Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因与其内参吸光度值的比值进行半定量比较，然后在组
间相互比较。

1.2.3 Western blot检测人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和
survivin蛋白的表达：使用组织裂解液提取各组细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。

取100～125 μg蛋白在10% SDS-PAGE胶上电泳，后转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF膜)，用TBST配制5%脱脂奶分别加入兔抗人Skp2、Bax、Bcl-2和survivin抗体(1∶1 000)，于常温孵育1.5 h；加入羊抗兔抗体IgG(1∶12 000)，常温孵育30 min，胶片曝光显影，以GAPDH为内参照。

1.3 统计学分析
采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析。

2.1 E2F-1基因过表达对人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因mRNA表达量的影响
LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA表达量低于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的mRNA 的表达量高于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)(图1，2；表1)。

2.2 E2F-1基因过表达对人胃癌MGC-803细胞E2F-1、Skp2、Bax、Bcl-2和survivin的蛋白表达量的影响
LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的蛋白表达量低于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)，E2F-1和Bax的蛋白的表达量高于LV-GFP组及空白对照组(Plt;0.05)(图3，表2)。

转录因子E2F-1是细胞G1期进入S期最重要的转录因子之一,调控着下游基因的表达。

Skp2参与调控细胞增殖和凋亡，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[4]。

Bcl-2家族分为促凋亡亚家族和抗凋亡亚家族，而Bcl-2和Bax分别为这两个亚家族的经典代表[5-6]。

Survivin是一种凋亡抑制蛋白，其具有抑制细胞凋亡和促进细胞异常增殖的作用[7]。

前期研究表明，E2F-1基因过表达可以抑制胃癌细胞的
增殖、迁移和侵袭力，促进胃癌细胞凋亡[2]；前期的体内动物实验也发现：含有
转录因子E2F-1基因过表达的重组反转录病毒载体瘤内注射可抑制人胃癌裸鼠移
植瘤的生长[3]，但机制尚不明确。

因此，探索E2F-1过表达对凋亡相关基因
Skp2、Bax、Bcl-2和survivin表达的影响，研究其可能的作用机制具有重要意义。

本研究表明LV-E2F-1-GFP组Skp2、Bcl-2和survivin的mRNA和蛋白的表达
量显著降低，而Bax显著升高。

有研究表明，Skp2表达下降，从而解除了Skp2
对P27的抑制[8]，而P27基因高表达通过EGFR/PI3K/Akt信号通路可使细胞DNA合成受抑制，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖[9]。

Bcl-2编码的蛋白主要作
用是保持线粒体膜的完整性, 抑制细胞色素C的释放, 从而促进细胞生存，抑制细
胞凋亡[10]，而Bax蛋白可拮抗Bcl-2的保护效应从而使细胞趋于凋亡[11]。

Survivin的表达水平下调使caspase-3、caspase-9和Bax在mRNA和蛋白水平上表达增加[12-13]，从而间接解除了survivin过表达对caspase-9、caspase-3、bax基因表达的抑制作用，启动了凋亡的信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡。

本研究表明，E2F-1基因过表达可使人胃癌MGC-803细胞中凋亡相关基因Skp2、Bcl-2
和survivin的mRNA及蛋白表达水平均显著下调，基因Bax的mRNA及蛋白表达水平均上调，与前期研究E2F-1过表达可抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进了胃癌细胞凋亡的结果相一致。

因此，推测E2F-1过表达可通过对凋亡相
关基因Skp2、Bax、Bcl-2和survivin产生影响从而对胃癌细胞及其移植瘤起抑
制作用。

综上所述，本实验发现E2F-1过表达可抑制Skp2、Bcl-2和survivin的表达，促进Bax表达，这提示E2F-1极可能经过这些基因的信号传导通路发挥作用，引起
胃癌细胞生物学行为发生改变，抑制胃癌的进展。

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