黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究

第14卷　第3期武　汉　科　技　学　院　学　报V o1.14N o.3 2001年　9月　JOURNA L OF W UH AN I NSTIT UTE OF SCIE NCE AND TECH NO LOGY　Sep.　2001
黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究
王亚林　严建芳
(武汉工业学院生物与化学工程系武汉430022)
摘　要　研究了黑曲霉液体培养生产植酸酶的发酵工艺,研究了培养基碳源、诱导物、表面活性剂等因素对产酶的影响,对发酵时间、pH变化规律等进行了研究和分析。

关键词　植酸酶　黑曲霉　发酵　Ξ
中图分类号　Q815;Q814.9
植酸酶作为一种饲料和食品添加剂,在国内外已开始得到广泛应用,特别是由于其在改善环境方面的作用,更是受到人们的极大关注。

植酸酶主要存在于植物及微生物中,由于在微生物中含量较高而具有较大的开发价值。

目前,美国、荷兰和丹麦等国已先后运用发酵法生产植酸酶,我国也已在进行这方面的研究开发。

可以预计,植酸酶制剂将有良好的市场前景。

1　材料与方法
1.1　菌种
黑曲霉(Aspergillus niger)WS201,武汉工业学院微生物室保存。

1.2培养基
1.2.1种子培养基:豆芽汁蔗糖培养基。

1.2.2摇瓶发酵培养基(%):葡萄糖3.0,淀粉7.0,NH4NO30.5,蛋白胨0.2,CaCl20.2,MgS O4・7H2O0.05,K Cl0.05,MnS O4.4;H2O0.03,pH值5.5。

1.3培养方法
配制培养基时适当加热、摇动或搅拌,使淀粉溶解成液态或胶状,121℃灭菌20min。

在30±1℃下摇床培养3～5d(转速220～250r/min)。

1.4　植酸酶的测定
植酸酶活力的定义:37℃,pH5.5条件下每分钟从植酸钠中释放出1μm ol无机磷所需的酶为1u。

酶活测定方法:取0.1ml含酶液加至一洁净试管中;加入0.9ml反应液,反应液为含0.5%植酸钠的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH5.5),在37℃恒温反应30min;加入1ml10%三氯醋酸终止反应;加入2ml显色液,摇匀后静置15～30min显色,显色液由1%钼酸铵50ml与3.66
Ξ收稿日期:2001-06-26
作者简介:王亚林,男,副教授,在读博士生;研究方向:发酵工程、生化工程
23 武　汉　科　技　学　院　学　报 2001年
g FeS O4・7H2O混合配制。

将以上蓝色溶液在721分光光度计上于750nm处比色,读出吸光度A750nm,查标准曲线计算酶活(标准曲线为KH2PO4中磷含量与A750nm的关系曲线)。

2　结果与讨论
2.1发酵培养基的研究
2.1.1培养基碳源含量的影响
选择葡萄糖和玉米淀粉为黑曲霉培养的碳源,葡萄糖和玉米淀粉用量之比为3∶7,培养基碳源的含量指葡萄糖和玉米淀粉用量之和。

不同碳源用量发酵试验结果见表1(每个试验均做2～3个重复,结果取平均值,下同)。

表1　培养基碳源的含量对产酶的影响
试验编号12345
碳源含量(%)7.08.510.011.513.0
酶活(u/ml)32.346.536.137.434.0
试验中发现当碳源用量超过10%时,培养基粘度过大,造成培养基供氧不足,菌丝生长不良,产酶下降且残糖过高。

因而碳源用量以8.5%为宜。

2.1.2植酸钠的添加效果
植酸酶为一种诱导酶,理论上底物或底物类似物对植酸酶的产生应该有一定的诱导作用。

本试验选择植酸钠为诱导物,在培养基中少量添加,诱导植酸酶的产生,发酵产酶结果见表2。

表2　植酸钠添加对产植酸酶的影响
试验编号123456
植酸钠(%)00.050.100.150.200.25
酶活(u/ml)13.824.124.531.022.925.8
表2结果表明:少量添加植酸钠后产酶迅速增加,说明植酸钠有明显的诱导作用。

植酸钠用量在(0.05～0.15)%范围内时,产酶量可稳定在一个相对较高的水平,植酸钠用量过大则意义不大。

2.1.3表面活性剂的添加效果
黑曲霉产生的植酸酶是一种胞外酶,在培养基中添加少量的表面活性剂可提高细胞的通透性,有利于酶的产生。

本试验选用吐温-80(T W-80)为表面活性剂,设计了几种不同的用量,发酵产酶结果见表3。

表3　T W-80添加对产植酸酶的影响
试验编号12345
T W-80(%)00.050.100.150.20
酶活(u/ml)35.953.358.175.355.5
从表3结果可见,T W -80添加量为0.05%时,与不添加相比产酶增加明显;T W -80添加量为0.15%时,酶活达75.3(u/ml ),产酶提高2倍以上;T W -80添加量继续增加,则产酶开始下降,这是因为过量的表面活性剂会对细胞产生伤害之故。

2.2　发酵条件与过程研究2.2.1　培养时间与产酶的关系黑曲霉的发酵培养分为两个阶段,细胞生长阶段和产酶阶段,发酵应在产酶高峰期结束。

本试验研究了发酵时间与产酶的关系,试验结果见图1。

从图1可见,发酵前两天产酶水平极低,之后迅速提高,其中在72～84h 产酶维持在较高的水平,然后产酶开始缓慢下降。

因此,发酵时间应为72～84h 。

2.2.2　pH 值与产酶的关系培养基初始pH 值与发酵产酶的关系见图2。

结果表明pH 值为5.5效果较好。

试验中发现,接种后黑曲霉生长导致pH 下降,培养24h 其pH 值从5.5降至3.8左右,之后pH 值缓慢回升。

为观察pH 值与产酶的关系,在培养至24h 人为调节pH 为5.5继续培养,结果显示这种调节对其产酶有一定的促进作用,但效果不是特别明显,这方面的工作有待继续,结果见图3、图4。

图1　培养时间与产酶的关系 图2　培养基初始pH
值对产酶的影响
图3　发酵液pH 值随时间的变化 图4　发酵过程pH 、酶活随时间的变化
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3第3期 王亚林　等:　黑曲霉植酸酶液体发酵工艺研究
43 武　汉　科　技　学　院　学　报 2001年3　结论
(1)培养基的研究表明:碳源用量以8.5%为宜;植酸钠有明显的诱导作用植酸钠用量在0.05%～0.15%范围内为宜;与不添加相比,T W-80添加产酶增加明显,添加量以0.15%为宜,酶活达75.3(u/ml),产酶提高2倍以上。

(2)发酵时间应以72～84h为宜;黑曲霉生长导致pH下降,在培养至24h人为调节pH为5.5继续培养,对其产酶有一定的促进作用。

参　考　文　献
[1]Y uong-ok kin,Hyung-kw oun kin.Purification and Properties of a therm ostable phytase from Bacillus sp.Ds11.En2
zyme Microb.T echnil.1998,22(3):226.
[2]张若寒.植酸酶活性的检测方法[J].中国饲料,1997,5:30232.
[3]石炳兴.植酸酶的制备性质及其在饲料工业的应用[J].上海饲料,1996,3:728.
Study on Aspergillus Niger Fermentation Processes of Phytase
W ANG Y a2lin　Y AN Jian2fang
Abstract　The processes of fermentation for producing Phytase were studied.These tests included com2 positions of culture medium,such as,C-res ources,ev ocator,external active reagent.The relationships of fermenting time and pH were studied and analysed.
K eyw ords　phytase;aspergillus niger;fermentation。