【doc】氯丙烯引起的神经电生理及细胞内Na^＋,K^＋,Ca^2＋等离…

氯丙烯引起的神经电生理及细胞内Na^＋,K^＋,Ca^2＋等离…
中国药理学与毒理学杂志I996年8月10(3):219223
R06
氯丙烯引起的神经电生理及细胞内Na,K,Ca等
离子含量的改变
谢克勤孙克任杨东昌高树君厉保秋张磊
,———
—可大学喜理学研究室,济南250012)
摘要为探讨氯丙埔竹周固神经损伤机制.用黄七
分子探朴,电子探针X缦微叵分}斤和屯生理学方法研
完了氟丙烯引起竹鸡胚神经细胞和太鼠坐骨神经纤维
轴幕由的Na,Ca离子和Na,K,CaMg,CI.P元素
含量和神经细胞静息膜电位fRMP),大鼠坐骨神经复
合动作屯垃(CAP)厦小鼠肋间神经柬膜内动柞电位
l(APIPS)竹班变结果显示,随着氟丙烯制量竹增加.鸡
\胚脑神经细胞[ca一l明显增加,[Na—l在高剂量叶亦增
加:太鼠坐骨神经轴裳内Ca增加.K减少,Na增加不
如Ca明显RMP疽小:太鼠坐骨神经CAP竹峰值明
显下降.时程稍延长:小鼠肿间神蛙APIPS的K电压
波形消失表明氟丙烯引起的RMP.CAP厦APIPS的
殖变.均与细胞和轴裳内竹Na,Ca离子和NaK,
Ca,Mg,Cl,P元素的改变有关提示中毒患者出现运
动和感觉障碍可能与轴裳内外NaK浓度盖碱小造
成神经兴奋与传导降低和Ca进^轴浆过多导致神经
纤维变性有关
美键词文丙烯:钠:却:{f5:神经元神经纤
堆:屯生理学:毒理学———一一一.一———一
—一●-——一
氯烯(allylchloride).为不饱和氯代脂肪烃类化
台物,有高度挥发性,是生产聚丙烯酰胺.环氧氯丙烷
和某些农药等的重要化工料.国外未曾报道其对周
围砷经系统的损伤我国自70年代起发现长期低浓度接触可引起神经衰弱综合征和对称性轴突变性型周围神经病"中毒患者临床检查可出现对称性远端运动
及感觉障碍,如四肢麻痛,腿软无力,远端感觉呈手套
株套样分布肌电图表现为轻度收缩时多相渡增加,重
度收缩时呈混合型或混合兼干扰型放电,均为低电压, 时程延长.神经传导速度表明腓总种经运动传导速度
减慢,远端潜伏期明显延长1.为深入研究氯丙烯引起
l995—0622收稿l996—03l8接受
.国衰自然科学基金资助课题.弛39170661
部分工作由谢克勤在英国DepartmentofPhysiologyand Pharmacology,Strath~lydeUniversity完成
2l9?
的周围神经损伤机理,l奉文用荧光分子探针Fura
2/AM和SBFI/AM,电子探针x线微区分析(elec. tronprobeXraymicroanalysisEPMA)和电生理学
方法探讨氯丙烯引起的鸡胚脑神经细胞内Na一,
Ca含量,大鼠坐骨神经纤维轴浆内Na,KCa,Mg.
CI,P无素的含量和神经骞玎胞静息膜电位(restingmem brahepotential,RMP},坐骨神经复合动作电位(com. poundactionpotential,CAP).肋1日J神经束膜内动作电位(actionpotentialinsideperineurialsheathAPIPS)
的改变,阐明士要的离子含量改变与电生理政变之^白l 的关系以便进一步探讨其引起的中毒性周围神经病
的发病机制
1材料与方法
1.1Fura2/AM购于美国Sigma公司SBFI/AM
由美国MolecularProbes公司提供氯丙烯为上海试
剂一厂生产超纯水由本系中心实验室提供180～220
g0大鼠由本控动物实验中心供给2O～25g小鼠由英
国斯特拉斯克菜德大学动物室提供
1.2脑神经细胞细胞内游离钙含量(ICa¨1.)和细胞内
游离~ll(INaIJ的测定
用14d海兰鸡胚(山东农业科学院家禽研究所提
供),在无菌条件下取头部.剥离腩膜取出酗组织放人冰Hanks液中,剪碎,离心弃上清液,加0.I25%胰氍白酶
2mL_放人37℃水浴,时振摇20rain离心弃上清
液.加Eagle培养液(含10%小牛血清)5mL中止消
化.200目铜网过滤后离心弃L清液,再用Hanks液洗
1改,蛀后用Eagle培养液调节细胞密度为2×10L1,
制成细胞悬液取3mL细胞悬液37℃水搭预温5rain 后.加八Fura2/AM20L(终浓度约5pmo[?L0),
37℃水崭不时振摇45min,使Fura2/AM进八细胞
内.装载后细胞用含02%牛血清白蛋白的Hanks液冼
2次.用Hanks液制成细胞悬渡细胞悬液加人不同浓
度氯内烯,37℃水浴预温3rain后.口立850型荧光分
兜光度计(只本)测荧光强度.根据公式计算[Ca1.
SBFI/AM的装载按上述Fura2/AM的装
方法进行.其终敞度约10,umol?L,【Na的测'
ChineseJournalPharmaeologyandToxicologvI996Aug;10(3) 件同[Ca2+.删得的荧光强度与空白对照比较
1.3电子探针x线微区分析大鼠坐骨神经轴浆内Na,
K,Ca,Mg,CI,P元素的含量
9H大鼠分3组.染毒组腹部分别se氯丙烯100
和200mg?kgi,对照组给生理盐水,每月1次.连续
9d停止染毒24h后断l头处死.迅速取出坐骨神经放
人液氨中.冷冻后用AO976C型冰冻组织切片机(uSA)切片(40m).放在玻片上,经丙酮脱水真空干
燥启喷碳,用JxA733型扫描电镜(JEOL.日本)和
AN10/855型电子探针能谱分析系统(Link,英国)
删定大鼠坐骨神经轴浆内Na.K.Ca.Mg,CI,P元素
的含量.能谱分析系统中各元素的内标含量为
l00%.
1.4细胞静息膜电位定
用NG10815细胞系,取2mL细胞悬液(1×
10L.)在35mm的培养皿里用分化液(99%Eagle,
I‰01mol?L.dbcAMP.
终浓度为lmmo|?L..).
37℃,5%CO,孵箱内培养7d后,加入氯丙烯染毒24
h,选30个左右分化成熟的细胞进行RMP测定微电
桠内充3mol?LKCI.电阻在60～80M【).用一高
阻抗的直流电流放大器(WPInstruments,model 750).膜电位在示波器上直接读取在褥】量期问用BES 缓冲液~mmol?L.:BEN,Nbis(2hydroxyethy1)
2.aminoethanesu]phonicacid)20;NaCI110;KCI5: CaCI,2.4;MgCI,1.7:葡萄糖253维持pH74.
1,5太鼠坐骨神经复合动作电位测定
6只大鼠分2组染毒组腹部Sc氯丙烯I50mg?
.
,对照给生理盐水,每日1次,连续9d停止染毒
24h后戊巴比妥麻醉.暴露坐骨一腓神经干35～4O
mm近端置刺擞电极2根,远端置引导电极2根,中问置接地电极.用SEN一320I型方波捌擞器l～2mA,
0lms,每秒1次,放大器频响50Hz,RM一6100型多
导生物记录仪(日本)记录cAP.
1.6小鼠肋间神经神经束膜内动作电位定.哪
小鼠脱颈处死后取左侧胸廓,放在Krebs—
Henseleit缓冲渡盛泷(15～2OmL?min.)的平皿内.
在解剖镜下靠胸骨端剪掉3根肋骨,暴露肋间神经末梢将标本固定故在有机玻璃制成的搭槽内(15cmJ
微电极内充2mol?L.NaCI(5～l5M【)),插进肋1日J
神经近末梢的神经束膜内用超最大电压.5O,Us.2s刺激1次.高阻抗的流电施放大器{wPInstruments model70I)和示波器显示刺激后的动作电位.采相机
记录垒部罔形波形稳定l0min后.将氯丙烯累积加入
灌流液中,每次给药l0min后记录APIPS波形
2结果
2.1氯丙烯对神经细胞lcahl_gllNall的影响
用装载Fura2/AM的鸡胚脑神经细胞分别加
入不同浓度的氯丙烯,随着维度的增加.[CaH1.也明显增加并有很好的量效关系(表"
Tab1.ChangesofchickenbraincellICa1land Naqinducedbyallylchloride(Ac)
Testwasbegunat37℃3mJnafteraddingAC[Ca】.: intracegu]arfreecalciumcontentfNal_.:intracellularfreeso- diumcontentFI:i~uoresconc,eintenskyi±4''P<
paredwithAC0mmol?Ll
用装载SBFI/AM的鸡胚脑神经细胞,分别加入
氯丙烯后.从表l可以看出,随着氯l内烯浓度的增加, 【Na】.的荧光强度也明显增加表明【Na】.朋显增加
I613和3I8.4mmol?L.氯丙烯组的荧光强度与对照
相比分别增加了I2.4%和225%.
2.2氯丙烯对大鼠坐骨神经轴浆内Na,K,Ca,Mg,
CI.P元素含量的影响
大鼠坐骨神经轴浆内Ca,Na,Mg元素含量随着
氯l丙烯浓度的增加而明显增加iK.P元素的含量别随
着其浓度的增加而降低低剂量组使c1元素的含量升
高,高剂量组则使c1的含量降低(表2)
Tab2.Changesofrelativecontentsofmalnelementsinducedbyallylchlorideinaxonofratsci atichelve
ACwasgivensconceadayfor9dTestwasbegun24hafterthelastdoseofACThecontentofeac helementinelectronprobe
X~raymLcroanalysiswastakenas100%±.3'尸<0.05.一P<0.01,comparedw/thOmg?kg
中国药理学与毒理学杂志l996年8月,10(3)
2.3氯丙烯对细胞静息膜电位的影响
用NG10815细胞系加^氯丙烯染毒24h后的
结果显示随着浓度的增加.细胞RMP减小.有明显的
量教关系(表3)
Tab3.ChangesofNG108_15cellrestingmembrane
potential(RMP)inducedbyallylchloride
NG108—15cellswereexposedinACfor24hi'P<
paredwith0mmol?L.
2.4氯丙烯对大鼠坐骨神经复合动作电位的影响
大鼠染毒后记录cAP的结果表明.对照组一3)
cAP的峰值为1.78±007123V,时程为368±52ms;
染毒组=3)cAP的峰值为O62±O08mV,时程为
40.8±4.1Ms染毒后的cAP峰值与对照相比降低
65%.时程稍延长(图1)
2.5氯丙烯对小鼠肋间神经束膜内动作电位的影响
用小鼠左侧胸骨三角神经肌肉标本.微电极插八
肋问神经束膜内记录APIPS波形图2A为加氯丙烯前
的波形第一个向下的波形与Na内流有关,第二个向
下的波形与K外流有关加八氯丙烯6l2mmol?
L'10min后K流波峰开始减tb;氯烯浓度增至
122,4mmo]?L'10rain后完垒消失(图2B,C=3)
221
Fig2.Changesofmouseribne1%,eactionpotential
insideperineurialsheath(APIPSJinducedbyallylchlo
ride.A ThenorraalAPIPSB:APIPS10rainafter6】2
mmolL.ACCAPIPS】0rainafterI224ramol?L.
ACN:Nainwardcurrent;K:Koutwardcurrent
Na十内流的波形没有K外流的波形变化明显.波峰稍
减小
3讨论
目前认为,许多毒物和药物耐不同细胞的毒性作
用均与Ca2+稳态失调有关J.然而随着EPMA技术在
神经科学的应用.使人们发现在损伤的细胞内除了
Ca的改变以外.还有其它离子含量的改变LoPachin
等"曾发现由于缺血引起的神经组织细胞死亡.细胞
内的Na.Ca.C1元素都增加而K别降低在
～叫
L
Fig1.Changesofratsciaticnel~'ecompoundactionpotential(CAP)inducedbyaUylchloride .A:ThenorlrtalCAPB
TheCAPafter150mg-kg.AC.
sc.Dnceadayfor9days.
ChineseJournalofPharmacologyandToxicology1996Aug;10(3) Wallerian变性的神经标书中Na.Ca明显增加.K则
降低20%～30%…J.Y ong等0报道脊髓损伤lh和3
h后损伤部住的总K降低分别为埘照的5O%和35%.
总Ca增加37%和59%本文用EPMA技术发现染毒
后的大鼠坐骨神经轴浆内Na,Ca和Mg含量随着氯
丙烯的增加而明显升高:而K.P含量则明显降低:CI
删小剂量增高犬剂量降低与LoPachin等报道的细胞
损伤后细胞内NaCaK的变化结果相一致用荧光分
子探针Fura2/AM和SBFI/AM测得的氯l内烯染
毒后的鸡胚脯神~g[Ca~fl[Na—l的结果也进一
步表明,随着氯丙烯浓度的增加[Ca+].和【Nal都明
显增加,但[Na].增加没有【Ca增加迅速在低剂量
(4O72mmo[?L.)时a1.没有明显改变,适时[cal
巳增加256倍(表【)达一现象用EPMA发现氯丙
烯染毒后大鼠坐骨神经轴浆内Na没有Ca增加明显
的结果相吻合(表2).揭示氯丙烯中毒后在细胞内除了
Ca2+的增加外还有Na一的增加和K的降低
实验证明,身开胞外高K可使RMP减小这种减小
与细胞内外K浓度差减少有关"31本文用NG108
15细胞测定RMP的结果显示,氯丙烯可使细胞RMP
减小根据荧光舟子探针和EMPA的结果.氯丙烯导
致细胞RMP减小的原因,可能除了细胞内K降低使
细胞内外浓度差减少外,还与细胞内NaCa计增加有
关
动作电位与离于的改变也密切相关神经细胞兴
奋时,由于细胞内外的Na一和K敞度差.使Na和
K一舟别形成动作电位的上升相和下降相.其峰值的大
小取决于细胞内外Na+和K的电化学梯度.如果细胞
外低Na,可使细胞内外浓度羞减少,导致动作电位降低"本文观察了在体大鼠坐骨神经的CAP和离体小
鼠肋问神经APIPS.结果都表现CAP峰值和Na
K电位降低这一结果与EPMA和荧光分子探针的结
果相平行,表明与轴浆内外Na一和K的浓度差减少有关.APIPS结果还进一步表明动作电位与Ca有关Mallart[Sl曾指出,APIPS第二个向下的电压波形是由Ca>内流电流和K外流电流组成当加入K通道阻断剂四乙铵后.可见向上的Ca卜内流电压波形.由于
ca针内流电流比K外流电流小.町被抵消.因此在正常
情况下所表现的仅是K外流电压波形.根据本文研究
结果所示.氯丙烯染毒后.细胞和轴浆内除Na一增加和K降低外.Ca2+也明显增加.因此提示町能由于Can内
流增加,电流增强,使通常K外流的波形变小:或者可
能由于Ca2+内流增加.增加了细胞内Ca2十.撒活钙依糊性钾通道(CaactivatedKchanne1).使K外流增
多,导致神经束膜内,也就是轴浆外高K,刺撒引起
动作电位时.由于轴浆内外K—浓度差已减小.造成
K一外流的波形减小消失:或者两者机制都有可能存在Na内流电流描记的第一个向下的电压波形变化没有Ca卜,K明显与本次的荧光分子探针和EPMA的结
果也相一致
本文通过鸡旺神经细胞测定[Na】.和【caH】.变化.
大鼠坐骨神经轴浆内Na,K.Ca.Mg,C1P元素的百
舟含量变化.舟析了Na'.CaK的变化与RMP. CAPAPIPS之的关系揭示氯_内烯引起的RMP. CAPAPIPS的变化.均与Na一.Ca.K的变化有关
提示中毒患者出现的运动和感觉障碍的机制可能是由于轴浆内CaNa的增加和K的减少使轴浆内外.
Na和的浓度差减少.造成动作电位减低导致神经
兴奋和传导障碍;过多的Ca进入轴浆内.可激活一系
列生化反应,使蛋白磷酸化.造成轴突变性.最终导致
中毒性周围神经病的发生
4参考文献
】lfI东省人民医院睨业病科,济南市中心医院职业病科.山东医学院卫生学教研组.济南向阳石油化厂】J生室环
氧氢丙烷生产中中毒性神经炎的研究卫生研究1976.
5f6:463469
2山东医学院】J生学教研组.Ilj束省^民医院职业病科济
南市中心医院职业病科.济南向阳石油化工厂卫生宣氯
丙烯.环氧氯丙烷.二氯丙醇和=氯丙烷的毒性研究卫生
研究.I976.5(45):317326
j中国医学科学院卫生研究所临床研究室,中国人民解放军总医院脑系科肌电图室慢性氧丙烯中毒引起多发性神经
病的临床研究中华医学杂志.I980.60(I2)746—749
4山东压学院卫生学教研室,…东医学院机能教研富生理组. 【JI束省^民医院职业病科.济南市中心医院职业病科.济
南向阳石油化1=厂_丙烯和环氧氯丙烷作片{原理的初步
探讨——时螗蜍坐骨一腓神经动作电位的影响卫生研究, 1976.5(6]469475
5何凤生.张寿林职业性慢性氯丙烯中毒诊断的探"中华
劳动卫生职业病杂志.19842(I):50—54
6李明.王俊峰.韩济生张均田应用Fura2/AM桂测
分离的神经细胞内_蔚离钙及土(变化.药学.1991,
26f】2)+890894
7BorinMSiffertWStimulationbythrombinincreasesthe
cytoso[mfreeNa'concentrationinhumanpIateIetsStud ieswiththenovelnuorescentcytoso[icNa—indicatorso. diumbindingbenzofuranisophthaIateJBiolChem.
I99t3.2,65(32):【9543【9550
8Ma【rtAElectriccurrentflowinsideperineuria[sheaths
中国药理学与毒理学杂志I996年8月:10(3) ofmousemotornervesJPhvsiolLondl985.368:
565575
9Carafo【lEIntracellularcalciumhomeostasisAnnuRev Biochem.】987:56:395433
0LoPachinRMJrLoPachinVRSaubermannAJX—ray microprobeanalysisofsubcellularelementaldistribution innormalandinjuredperipheralnerveaxonsIn:Fiskum
Ged.CellCalciumMetabolism.-PhyMologP.Biochemistry Pharmacology,andClinicalImplicationsNewY ork: PlenumPress】989.479-489
1LoPachinRMJrLoPaclainVRSaubermanflAJEfiects ofaxotomyondistributionandconcentrationofeLements inratsciatic~erveJNeurochem【99054f¨320332
2Y ongW.KorehI.Potassiumandcalciumchangesinin. juredspinalcordsBrainRes.1986,365(I).4253
3蔡南…戴鸿佐,张澈赋.缪明,韩匀茹线彦,辅译神
经生物学上海'复旦大学出版社,【9927085 Changesinelectr0physi0l0gyandNa+
,
K+
,
Ca2+contents
inducedbyallylchlorideinnervetissue
X1EKe—Qin,SUNKe—Ren,YANGDong—Chang,GAOShulun LIBaoQiu,ZHANGLei
(InstituteofToxicology,ShandongMedicalUniversityJinan.250012)
ABSrRACTUsingthemethodsofflBorescence molecularprobe,electronprobeXraymicroanalysis (EPMA)andeloctrophysiologicaltechnique,thefol- lowingchangesinducedbyallylchloride(AC)werestu- died,includingmainionsorelements(Na.Caand Na,K,Ca,Mg,CI,P)lnnerveceilsandnerveaxon, restingmembranepotentiaI(RMP)inNG108I5cell line,compoundactionpotentia】(CAP)inratsciatic nerve.andactionpotentjalinsideperineuriaIsheath (APIPS)inmiceintercostalnerve.Theresultsshowed thatasACwasadded.1Caincreasedmarkedly,but lNa】.didnotchangeinthebrainnerveceilsofchick. enembryoat1owACdose;elementCaincreasedand elementKdecreasedsignificantly,butelementNajust increasedslightlyinratsciaticnerveaxon~RMPbe? camesmaller;CAPfe【ldown;APIPSshowedthegrad. uald】sappearanceofthewaveformofKoutwardcur- rent.TheresultsrevealthatthechangesofRMP,CAP andAPIPSinducedbvACareassociatedwiththevari. ationsofNa,CaionsandelementsNa,K,Ca.Mg, ClandPlnnerveeellandnerveaxon.andalsondi. catethattheIoweredNaandKc0ncentrati0ndi脏r.
en0esbetweeninsideandoutsideofnerveaxonandin. creasedCa2+innerveaxonmightfurtherresultinthe axondegenerationandthedepressionofnerve excitationandconductjon KEYWORDSallylchloride;sodium;
potassium;calcium;neurons;nervefibers; electrophysiology;toxicology
.Projectsuppor~dbytheNationalNatureScienceFoun-
dationofChina.怕39170661。