PCRDNA电泳相关问题

DNA电泳常见问题分析之一
1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解
决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。

胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。

一个让PAGE胶很快聚合的方法：
不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。

在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。

配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。

2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？
1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm 即可。

2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。

3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。

3 跑出的DNA带模糊？
1、DNA降解：避免核酸酶污染。

2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

建议经常更换电泳缓冲液。

3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

4、DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。

5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。

7、DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

4 有不规则DNA带迁移?
1、对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。

2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。

3、DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。

5 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？
1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。

2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。

3、DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。

4、对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。

6 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?
1、如果是小DNA带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。

2、分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。

3、DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。

DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。

7 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？
有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。

有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。

也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。

然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。

8 跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？
还有个问题，pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。

我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？
割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。

切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。

9 凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。

还有就是洗脱的那一步。

洗脱的时候最好用加热到60度的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。

10 切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？
可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。

注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。

RNA 用具要用10%的NaOH浸泡过液，再用DEPC 水冲洗干净 70%的乙醇用过国产分析乙醇有杂质，RNA酶还会有，并带入其它污染。

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

但操作过程中仍有不少要注意的问题。

1 凝胶制作
1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。

粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。

以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。

核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色。

1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。

梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。

另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。

当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。

2 点样
点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入孑L底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。

上样缓冲液储存液一般为6× (10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。

使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。

点样方法是将移液器基本垂直点样孑L，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。

3 电泳
将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。

电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。

电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。

另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。

4 结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样?
溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5 vg／ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。

特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。

实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过2 0％，较小的核酸片段在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负傲移动，如果将凝胶置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min，较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存.。