Caspase-3,9在冠心病心肌缺血-再灌注中时间效应的相关研究

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研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日
前言
（Introduction）
冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary atherosclerotic heart disease）简称冠心病（coronary heart disease, CHD）一直是世界上高发病率、高死亡率的疾病之一，严重危害着人类的健康。

冠心病是指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞，或（和）因冠状动脉功能性改变（痉挛）导致心肌缺血、缺氧或坏死而引起的心脏病，亦称缺血性心脏病（ischemic heart disease）。

近年来，随着经济的快速发展、医疗技术的不断改进及预防工作的广泛开展，冠心病的发病率及死亡率都在降低，但在发达国家仍然为主要的致死原因，据2001年世界卫生组织报告，80%的死亡病例分布在包括中国在内的发展中国家[1]。

冠心病的病因较为复杂，与多种危险因素相关，其确切的病理生理机制目前尚未完全确定。

近些年来，随着经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）、静脉溶栓治疗以及紧急主动脉-冠状动脉旁路移植术的广泛开展，冠心病患者缺血的心肌及时得到血液再灌注，这在保护心脏功能方面起着重要作用。

缺血-再灌注损伤( ischemia－ reperfusion injury)的概念是由Jennings1960年首次提出[2]的，近些年来受到医学界的高度重视。

缺血-再灌注损伤指缺血的器官、组织或细胞在恢复血液再灌注后出现的部分器官、组织或细胞功能代谢障碍及结构破坏加重的现象。

大量动物实验及临床观察均显示再灌注在有效改善心肌缺血，使损伤的心肌细胞得到修复的同时又加重了单纯心肌缺血造成的损伤[3]。

近年来，随着对缺血-再灌注损伤发生机制不断深入地研究，目前普遍认为心肌再灌注损伤与心肌细胞凋亡关系密切，再灌注损伤是细胞凋亡的重要因素之一。

众多学者均认为,凋亡是心肌缺血-再灌注细胞死亡的一种主要形式[4-7]。

因此，研究缺血-再灌注中心肌细胞的凋亡机制，从而有效阻断心肌细胞的凋亡，减少再灌注后的心肌损伤，保护心脏功能，已成为近年来人们研究的热点。

在众多的凋亡因子中，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase ，Caspase）家族是凋亡过程中的关键元件，它的激活与超长表达可通过与众多蛋白因子的相互作用来调控细胞凋亡[8]。

在Caspase 参与的线粒体依赖的细胞凋亡途径中，当各种因素导致线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential，△ψm）发生改变使线粒体膜通透性增大时，细胞凋亡启动因子如细胞色素C（cytochrome c，Cyt．C）、凋亡蛋白酶激活因子（apoptotic protease activating factor，Apaf）和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等从线粒体内释放出来，从而触发caspase的级联反应，在此凋亡有序级联反应中，处于上游的Caspase-9与处于下游的Caspase-3在多种凋亡信号作用下被顺序激活，从而对多种蛋白底物进行降解，最终引起细胞凋亡。

既往以动物为基础构建缺血-再灌注模型的研究中表明Caspase表达活性具有时间相关性，在心肌缺血后再灌注早期即有心肌细胞的凋亡发生，在随后的观察时间里随着再灌注时间的延长逐渐增多，而Caspsase-3mRNA表达水平的增高趋势与细胞凋亡数一致，应用
Caspsase抑制剂能有效抑制其表达活性减少心肌细胞凋亡。

目前临床上以人为基础的研究仅限于在一些外科手术及大型仪器检查中对心肌病变组织的测定，这些研究方法均有一定的局限性。

有国外学者[9]用酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)进行了血浆Caspase-1水平与冠心病患者心血管死亡风险的相关研究，这为缺血-再灌中细胞凋亡的研究提供了新的思路。

鉴于Caspsas-3,9在缺血-再灌注诱导细胞凋亡过程中的重要作用及目前相关临床研究的局限性，本课题选择凋亡因子Caspsas-3,9，研究其在冠心病心肌缺血-再灌注诱导细胞凋亡过程中的时间效应。

本课题采用ELISA法检测冠心病患者PCI手术前、后血清中Caspsas-3,9的表达活性，研究其在冠心病心肌缺血-再灌注中的时间效应性。

通过对PCI手术患者手术前、后不同时间点Caspsas-3,9表达活性的检测，探讨其表达活性在再灌注前后随时间变化的规律，从而进一步了解冠心病心肌缺血-再灌注细胞凋亡的发生、发展机制，亦为通过在相应的时间内抑制其表达，减少心肌细胞凋亡，防治缺血-再灌注引起的细胞损伤提供可供临床参考的依据。

材料和方法
（Meterials and Methods）
1 研究材料
1.1 研究对象及分组
1.1.1研究对象
选取2009年12月至2010年8月期间在新疆生产建设兵团医院心血管内科住院疑似或已诊断为冠心病的患者，所有患者术前均经知情同意，并签署临床研究的知情同意书及相关手术同意书后行冠状动脉造影术（CAG），CAG术后明确诊断为冠心病并行PCI 术者纳入PCI组，共30例；因胸闷、胸痛、心电图提示有心肌缺血，无PCI适应症而单纯行CAG者纳入CAG组，共29例。

所有患者排除肿瘤、自身免疫性疾病、心衰、神经元退行性疾病（阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、多发性硬化症等）、HIV病毒感染等可引起细胞凋亡的疾病以及不能解释的发热、未治疗的感染、Hb<80g/L的严重贫血、严重电解质的失衡、严重活动性出血、未控制的高血压、洋地黄中毒、以前有造影剂过敏但事先未用糖皮质激素治疗、中风的活动期、急性肾衰、肺水肿等不能行冠状动脉造影的患者。

1.1.2 CAG及PCI分组情况
根据CAG检查结果，冠状动脉血管的狭窄程度≥70%，同时行冠状动脉球囊扩张术和（或）支架植入术(二者统称PCI)的患者纳入PCI组；狭窄程度＜70%，单纯行CAG 的患者（包括冠状动脉正常、狭窄＜50%的冠状动脉硬化患者以及狭窄≥50%的冠状动脉病变患者）纳入CAG组。

1.2质量控制
为保证本研究数据资料的完整性、准确性及可靠性，对所有参加本研究的人员进行统一培训，明确本研究的流程、目的、意义、方法及注意事项。

实验组（PCI组）与对照组（CAG组）的入选工作均由主治医师以上职称经验丰富的心血管内科医师担任，同时担任冠状动脉造影及冠状动脉介入治疗的操作者，以保证入组患者诊断标准的精确性。

同时两组患者血液样本的采集及Caspase活性的检测由熟悉该项操作的专职人员按实验要求严格实施，所有实验室检测所用的各种仪器均符合国家有关计量检测的标准，以保证样本质量的统一性及检测结果的准确性，减少人为误差。

实验数据的统计及整理工作由专人担任，所有数据均输入计算机建立数据库，并准确核对，及时发现有问题的数据，核对原数据后加以改正。

1.3主要试剂
人Caspase-3ELISA检测试剂盒美国R&D公司产品
人Caspase-9ELISA检测试剂盒美国R&D公司产品
1.4主要仪器
(1)KDC-1044低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司
(2)500µl、200µl、100µl、10ul加样器德国eppendorf公司
上海求精生化试剂仪器有限公司(3)MICRO PLUS LABAT2
全自动免疫加样系统瑞士哈美顿（HAMILTON）公司
(4)XK-98-A电子石英钟重庆蜀江科技贸易有限公司
(5)MM-2微型振荡器江苏金培市医疗仪器厂
(6)HH．W21恒温水浴箱北京光明医疗仪器厂
(7)BLORAD MODEL 1575洗板机美国伯乐公司
(8)MULTISKAN MK3 酶标仪美国Thermo Fisher Scientific公司
(9)EPSON LQ-300K打印机爱普生（中国）有限公司
(10) 海尔超低温冰箱青岛海尔公司
2 研究方法
2.1 技术路线
2.2 标本的采集、处理与保存
通过对疑似或已诊断为冠心病的患者行CAG，根据检查结果，对冠状动脉狭窄程度≥70%的患者（PCI组）行冠状动脉介入治疗，此组患者存在缺血-再灌注的过程，在CAG术前0.5 h、PCI术后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 共6个时间点用标准真空采血管分别抽取患者外周静脉血4ml；对狭窄程度＜70%的患者（CAG组）在CAG术前0.5 h、术后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 共6个时间点分别抽取患者外周静脉血4ml，离心后迅速小心地分离血清，将其分装于EP（eppendorf）管内，-70℃保存待测。

标本避免反复冷冻，尽可能不使用溶血或高血脂血。

血清中有大量颗粒，检测前需先离心或过滤。

待测样本避免在37℃或更高的温度加热解冻，应在室温下解冻并确保样品均匀充分地解冻。

2.3 Caspase-3,9活性的检测
所有血清标本均使用美国R&D Systems生产的Caspase-3,9检测试剂盒，采用ELISA 法，并详细按说明书步骤进行检测，具体检测步骤如下：
①使用前，将所有试剂充分混匀。

不要使液体产生大量的泡沫。

以免加样时
加入大量的气泡，产生加样上的错误。

②根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。

每个标准品和空
白孔建议做复孔。

每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复
孔。

标本用标本稀释液1:1稀释后加入50ul于反应孔内。

③加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。

立即加入50ul的生物素标记的抗体。

盖上模板，轻轻振荡混匀，37℃温育
1小时。

④甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍
干。

重复此操作3次。

如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

⑤每孔加入80ul的亲和链霉素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

⑥甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍
干。

重复此操作3次。

如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

⑦每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。

避免光
照。

⑧取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后立即测定结果。

⑨在450nm波长处测定各孔的OD值。

2.4 结果判断与分析
①仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值。

②以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的P-selectin标准品浓度为横坐标（X），
做得相应的曲线，样品的P-selectin含量可根据其OD值由标准曲线换算
出相应的浓度，再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准
曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘
以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

③检测值范围：0-400ng/ml。

④敏感度：1.0ng/ml。

2.5 统计学分析
实验数据以均数±标准差(X±S)表示，用SPSS18.0软件包进行统计学分析，组间比较用秩和检验，重复测量资料用一般线性模型，以P<0.05具有统计学意义。

结果
（Results）
一、 研究对象的一般临床资料：
所有研究对象中单纯行CAG检查的患者为对照组,有PCI适应症并行PCI术的患者为实验组,两组患者均严格按照排除及纳入标准筛选后分别入组。

CAG组29例，平均年龄62.31±10.04岁，男女比例10：19，其中17例合并高血压，8例合并糖尿病。

PCI组30例，平均年龄59.70±8.36岁，男女比例24：6，其中19例合并高血压，5例合并糖尿病。

两组之间差异无统计学意义（P>0.05）。

二、 两组研究对象caspase-3,9水平的检测：
如表1所示，对6个时间点CAG组与PCI组的Caspase-3,9水平分别进行组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。

CAG组中术前与术后各时间点的Caspase-3,9水平差异均无统计学意义（P>0.05）。

PCI组中术后3 h、6 h的Caspase-3水平较术前0.5 h均有降低趋势，差异均有统计学意义（P<0.05），而PCI组的Caspase-9水平在术后虽有同样的降低趋势，但其差异无统计学意义（P>0.05），但术后48 h的Caspase-9水平与术后3 h、6 h相比均有升高趋势，差异均有统计学意义（P<0.05）。

表 1 血清 Caspase-3,9 水平
组别 Caspase-3（ng/ml）Caspase-9（ng/ml）
CAG 组
术前 0.5 h 36.27±53.31 13.76±23.60
术后 3 h 36.74±52.83 17.84±35.73
术后 6 h 37.27±62.77 16.43±37.26
术后 12 h 37.79±64.01 20.11±51.35
术后 24 h 38.72±56.90 16.39±30.69
术后 48 h 44.63±63.11 21.07±51.19 PCI组
术前 0.5 h 56.82±91.30 23.92±48.64
术后 3 h 51.48±90.70﹡ 19.90±42.34△
术后 6 h 51.65±84.55﹡ 22.64±50.34△
术后12 h 63.67±95.91 31.95±69.89
术后 24 h 65.16±105.94 31.73±66.60
术后 48 h 49.11±70.90 24.54±49.09 注：CAG：冠状动脉造影术；PCI：冠状动脉介入治疗；﹡与术前0.5h相比P<0.05；△与术后48h相比P<0.05
三、 冠状动脉病变与Caspase-3,9的关系
CAG组中所有患者均为择期手术，其中16人冠脉正常，13人为冠状动脉病变组（50%≤冠状动脉狭窄程度＜70%）。

PCI组均为冠状动脉病变患者，其中18人为心绞痛患者（70%≤冠状动脉狭窄程度＜完全闭塞），12人为急性心肌梗死患者（冠状动脉完全闭塞）。

如表2所示，CAG组中冠状动脉正常、冠状动脉病变两个亚组在术前及术后6个时间点之间的Caspase-3,9水平差异均无统计学意义（P>0.05）；PCI组的两个亚组中，70%≤冠状动脉狭窄程度＜完全闭塞亚组在术前及术后6个时间点之间的Caspase-3,9水平差异均无统计学意义（P>0.05），冠状动脉完全闭塞亚组术后6 h比术前0.5 h的Caspase-3水平降低，差异有统计学意义（P<0.05），术后48 h比术后6 h的Caspase-9水平升高，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2冠状动脉病变与Caspase-3,9的关系
CAG 组（n=29）PCI 组（n=30）
凋亡因子
正常
（n=16）50%≤冠脉管
腔狭窄程度
＜70%
（n=13）
70%≤冠脉
管腔狭窄
程度＜闭
塞（n=18）
冠脉闭塞
（n=12）
Caspase-3
（ng/ml）
术前0.5
h44.90±67.32 25.65±27.26 55.13±93.37 59.35±92.14 术后 3
h 43.88±66.87 27.96±27.77 51.65±86.75 51.23±100.29
术后 6
h 49.70±81.40 21.96±21.27 53.48±90.64 48.91±78.33﹡
术后12
h 49.77±83.47 23.05±20.66 53.33±78.62 79.18±119.41
术后24
h 44.13±66.88 32.06±43.31 50.02±85.88 87.86±131.36
术后48
h 53.15±79.47 34.16±34.04 42.18±54.00 59.51±92.47 Caspase-9
（ng/ml）
术前0.5
h16.16±29.87 10.81±12.93 27.60±60.60 18.39±22.45 术后 3 h 22.46±47.20 12.16±11.45 22.59±52.20 15.86±22.03
术后 6 h 22.33±49.17 9.16±10.67 27.02±63.66 16.08±18.40△
术后 12 h 27.26±68.26 11.31±13.29 26.27±64.72 40.48±79.19
术后24
h 19.32±39.01 12.78±16.40 26.41±64.48 39.69±71.78
术后48
h 27.41±67.91 13.25±15.20 27.10±61.35 20.71±22.58
注：CAG：冠状动脉造影术；PCI：冠状动脉介入治疗；﹡与术前0.5h相比P<0.05；△与术后48h相比P<0.05
讨论
（Discussion)
目前对于冠心病缺血心肌进行再灌注治疗包括三个方面：药物静脉溶栓治疗、PCI 及主动脉-冠状动脉旁路移植术。

随着PCI技术的不断进步及广泛开展，闭塞或狭窄的冠状动脉血流得到及时再恢复，这对于冠心病患者心脏功能的改善及疾病的预后起着重要作用。

但通过大量的动物实验及临床观察，人们发现部分动物或患者在再灌注后出现了心肌舒缩功能的降低、心律失常、心肌能量代谢障碍、超微结构的变化等现象[10]。

PCI 术后的部分患者也出现了严重的血流动力学改变，如血压骤降、心律失常、心功能不全甚至发生猝死等，人们将其原因归咎于缺血-再灌注损伤，因此缺血-再灌注损伤已成为目前众多学者们研究的热点课题之一。

一、Caspase-3,9在缺血-再灌注诱导细胞凋亡过程中的重要性
缺血-再灌注损伤的发生机制复杂，至今尚未彻底阐明，其可能的机制及假说有：氧自由基的损伤、细胞内钙超载、微血管损伤与白细胞的激活、能量代谢障碍、血管紧张素系统、细胞粘附分子等[11-16]。

有学者认为，再灌注损伤与心肌细胞凋亡关系密切，再灌注损伤是细胞凋亡的重要因素之一，而凋亡是心肌缺血-再灌注细胞死亡的一种主要形式[4-7]。

Caspase家族是凋亡过程中的关键元件，其激活与超长表达可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡[8]。

Caspase是Kerr JF等[17]在1972年发现的，至今已在哺乳动物中发现了14种，被称为Caspase家族，它们以非活化的酶原形式合成与储存于正常细胞中，无活性的酶原由四个不同的结构域组成[18-19]：氨基末端区域(prodomain)，一个大亚基、一个小亚基和一个位于大小亚基之间的连接片段。

Caspase的激活是通过蛋白水解，除去prodomain和连接片段后将大、小亚基重新组成一个异二聚体形式。

根据Caspase活性区域及功能的相似性，可以把其分为3大类[20]：①与炎症有关的Caspase，包括Caspase－1、－4、－5、－11、－12、－13和－14，主要参与细胞因子介导的炎症反应并在FasL和TNF等死亡受体介导的细胞凋亡途径中起辅助作用；②凋亡起始型Caspase，包括Caspase－2、－8、－9、－10，位于Caspase级联反应的上游，他们在其它因子的参与下自我活化并激活下游的Caspase；③效应Caspase，包括Caspase－3、－6、－7，位于Caspase级联反应的下游，能被上游的凋亡因子激活成活化形式，最终介导细胞凋亡。

目前认为，Caspase 可通过三条途径介导细胞凋亡。

第一条途径是线粒体依赖途径；第二条途径是FasL和TNF等死亡受体介导的Caspase 激活途径；第三条途径是内质网应激启动的凋亡途径。

尽管内质网应激途径在缺血-再灌注诱导细胞凋亡的过程中起不可忽视的作用，但死亡受体途径和线粒体依赖途径为其细胞凋亡的主要途径[21]。

目前对死亡受体途径的研究已比较清楚，故人们更重视对线粒体依赖途径的探讨。

当△ψm 在各种凋亡诱导因素的作用下降低时，线粒体内、外膜之间的通透性转换孔（permeability transition pore ,PTP）开放，导致线粒体膜通透性增大，使细胞凋亡启动因子如Cyt．C、
Apaf和AIF等从线粒体内释放出来。

Cyt．C与Apaf相互作用可激活Caspase-9，活化的Caspase-9激活Caspase-3酶原成为活化的Caspase-3，而AIF可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase-3的水解活性，从而引发Caspase的级联反应。

在此凋亡途径中，Caspase-9处于凋亡有序级联反应的上游，是凋亡启动因子，而Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活成活化形式，从而对多种蛋白底物进行降解，最终引起细胞凋亡，因此Caspase-3在细胞凋亡过程中起关键作用[22-24]，在凋亡的执行阶段，负责对全部或部分关键性蛋白的酶切(激活或灭活)。

其作用主要包括：①消化破坏细胞内多种蛋白酶复合体，如核层蛋白(Laminine)、凝胶蛋白(Gelsolin)等；②激活核内核酸酶，如激活 DNA片段因子45等，造成 DNA裂解破坏形成DNA片段；③通过特异地消化三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）4b亚基，破坏细胞的钙泵功能，造成细胞内钙超载。

上述作用共同导致细胞凋亡[25-26]。

缺血-再灌注时细胞凋亡的级联反应始于线粒体损伤和Caspase-9的激活（主要在内皮细胞）或死亡受体与配体结合和Caspase-8的激活（仅在心肌细胞，且在再灌注中增加）。

血管内皮细胞不仅是缺血-再灌注损伤的靶器官，也是心肌缺血-再灌注损伤的起始因子，正常的血管内皮细胞通过分泌血管活性物质调节血管的张力，维持凝血与纤溶间的平衡，抑制血小板与血管内皮细胞的黏附和聚集，白细胞与血管内皮细胞间的相互作用等调节血液与组织间的物质交换和器官的正常功能。

有文献报道[27]再灌注时不仅心肌细胞受损，也伴有冠状动脉内皮细胞的形态、结构、功能的严重受损，且再灌注时内皮细胞功能异常的时间早于实质细胞，内皮功能受损可破坏血液与组织间的物质交换屏障，打破了各种分子间的平衡，引起一系列的炎症及免疫反应，使冠状动脉微循环血管丧失舒张调节能力,造成活性氧及代谢物质在局部堆积,从而进一步加重实质细胞损伤。

故同时干预冠状动脉内皮细胞及心肌细胞的凋亡能更有效地防止缺血-再灌注损伤。

鉴于细胞凋亡在缺血-再灌注过程中的重要作用，本课题选择了凋亡因子Caspsase-3，9进行研究，旨在进一步了解冠心病心肌缺血-再灌注诱导细胞凋亡的发生、发展机制，为从Caspsase-3，9介导的线粒体激活途径干预细胞凋亡提供一定的参考依据。

二、血清Caspase-3，9的检测为临床上细胞凋亡的研究提供了新思路
目前国内外学者通过动物模型及临床观察研究探讨缺血-再灌注损伤及细胞凋亡的机制已取得了丰硕的成果，这对从多途径干预细胞的凋亡，防治缺血-再灌注损伤提供了大量宝贵的资料。

研究表明，无论是在低等的模式生物(如线虫、果蝇等)还是在高等的脊椎动物(如大鼠、恒河猴等)，再灌注导致细胞死亡的主要方式均是通过诱导细胞凋亡而产生的[28-29]。

国内学者应用纯化新生昆明系小鼠心肌细胞探讨缺氧诱导心肌细胞Caspsase家族信号途径的激活及其分子机制的研究，取得了显著成果。

但是既往研究多数是以借助动物实验来完成的，虽然在众多的实验中都制备了相似的动物模型，但是动物与人毕竟不能完
全等同，动物模型制备过程中的干预因素与人类疾病的致病因素不完全相同，故以此用来评价以人为基础的病理生理机制可能会存在一定的差异。

有报道[30]心外科学者在心脏外科手术中针对充血性心力衰竭患者，开胸建立体外循环后用心肌活检枪留取全层右心室心肌标本, 采用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）技术检测心肌细胞凋亡，并用Caspase-3 活性检测试剂盒测定右心室Caspase-3的酶活性，用流式细胞仪技术测定心肌细胞bcl-2 等相关蛋白的表达,用荧光强度代表bcl-2等蛋白含量。

类似的外科临床研究病例数比较局限，对心肌缺血-再灌注及细胞凋亡机制的探讨可能由此造成一定的影响，而且对医学伦理学是一种考验。

国外利用MRI及SPECT技术来研究心脏病的病理生理机制，但是这些研究使用的造影剂昂贵，而且MRI及SPECT对心脏检查的相关技术尚不成熟，对心肌病变组织的测定存在一定限制，而且重复性差，不易推广。

目前众多文献中对于凋亡细胞评估及凋亡相关因子的检测多为直接获取实质细胞进行测定的，此方法在临床观察中有一定的局限性。

有国外学者Blankenberg S[9]用ELISA 法进行了血浆Caspsase-1水平与冠心病患者心血管死亡风险的相关研究，为临床上干预细胞凋亡的研究提供了新的思路。

也有文献报道通过动物模型观察细胞质及血清中AIF 及Caspsase-9的变化，从而探讨缺血-再灌注后线粒体凋亡途径的机制[31]，但临床上尚未见对血清中Caspsase-3，9变化的报道。

既往对于缺血-再灌注中细胞凋亡机制的探讨仅限于以动物为基础的研究，少见有以人为基础的文献报道。

据此，本研究首次从冠心病患者外周静脉血中检测到了Caspsase-3，9的表达活性，并探讨了Caspsase-3，9在缺血-再灌注损伤中的时间效应，为临床上干预缺血-再灌注损伤中心肌细胞凋亡的研究提供了新的思路。

本课题中对于凋亡因子的检测方法简单，可重复性好，具有安全性，易于被患者接受，具有一定的可推广性。

三、Caspase-3，9在缺血-再灌注中的时间效应性及其对干预细胞凋亡的意义
既往动物实验表明在心肌缺血后再灌注早期即有心肌细胞的凋亡发生，在随后的观察时间里随着再灌注时间的延长逐渐增多；而Caspsase-3mRNA表达水平的增高趋势与细胞凋亡数一致。

如曾志勇等[32]在猫的体外循环实验中发现，再灌注15 min时心肌Caspsase-3mRNA的表达量较主动脉阻断前明显增加，再灌90 min时心肌 Caspsase-3 mRNA的表达量为主动脉阻断前的4倍；徐强等[33]研究大鼠心肌再灌不同时相Caspsase-3激活与心功能变化的关系，提出Caspsase-3激活是缺血-再灌注损伤后心肌细胞凋亡导致心功能下降的机制之一。

故抑制Caspase的高表达，从而减少细胞凋亡已经成为保护心脏功能的有效途径。

有研究[34]表明缺血或再灌注均可诱导细胞凋亡，心肌细胞凋亡指数随缺血或再灌注时间的延长呈渐增的趋势，在有关的动物模型中显示缺血48.5h和缺血30min再灌注48h。