裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化

裂殖壶菌发酵产DHA油脂的生产工艺优化
黎丽;窦光鹏;霍文严;魏巍
【摘要】采用磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌发酵产DHA油脂的积累情况,对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。

得到裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为：葡萄糖30 g/L,玉米浆粉6 g/L,蛋白胨4 g/L,硝酸钠3．6~3．9 g/L,海水晶15 g/L；在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外,通过流加3．0 g/L的大豆油来刺激菌体生长,最终经过72 h的流加培养,菌体湿重达到200 g/L,总油脂含量达到60%以上,油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。

%The accumulation of DHA oil produced by Schizochytrium sp. was real-timely monitored by phosphoric acid vanillin method, and the fermentation process for production of DHA oil by Schizochytri-um sp. was optimized. The results showed that the optimal formular of culture medium for growth and oil accumulation of Schizochytrium sp. were obtained as follows:glucose 30 g/L, corn steep powder 6 g/L, peptone 4
g/L, sodium nitrate 3. 6-3. 9 g/L, sea crystal 15 g/L. A certain dosage of glucose was fed to increase carbon-nitrogen ratio to improve oil accumulation and a fed batch of 3 . 0 g/L soybean oil could stimulate cell growth in 50 L fermentor. After fed batch fermentation for 72 h, wet weight of cell reached 200 g/L,total oil content was more than 60% and DHA content in the fatty acid composition of the oil ac-counted for about 22%.
【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】5页(P77-81)
【关键词】裂殖壶菌;DHA;发酵;工艺优化
【作者】黎丽;窦光鹏;霍文严;魏巍
【作者单位】山东百龙创园生物科技有限公司，山东禹城251200; 山东广博生物技术服务有限公司，山东禹城251200;山东百龙创园生物科技有限公司，山东禹城251200; 山东广博生物技术服务有限公司，山东禹城251200;山东百龙创园生物科技有限公司，山东禹城251200; 山东广博生物技术服务有限公司，山东禹城251200;山东百龙创园生物科技有限公司，山东禹城251200; 山东广博生物技术
服务有限公司，山东禹城251200
【正文语种】中文
【中图分类】TS225.6;TQ641
二十二碳六烯酸(Docosahexenoic acid，DHA)是一种极其重要的ω-3系列不饱
和脂肪酸[1]，具有促进婴幼儿大脑发育[2-3]、保护视力[4-6]、预防心血管疾病[7]、降血脂[8]、抑制肿瘤和提高免疫机能[9]等重要生理功能。

目前，DHA已广
泛应用在婴幼儿食品、保健品和辅助治疗剂[10-11]等方面。

DHA有两种生产方法：传统的深海鱼油提取法[12]和微生物发酵法[13]；鱼类资源因供应链限制、DHA
含量低以及鱼腥味等诸多不利因素，难以满足市场需求；微生物发酵法生产DHA，具有DHA含量高、微生物生长快、易于培养、对人畜无毒无害等优势，成为目前工业化生产DHA的主要方法。

裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)是目前DHA研究中最热门的微生物资源[14-15]。

本实验对裂殖壶菌发酵产DHA的培养基进行优化，以期提高DHA的生产水平，
为其工业化生产提供支持。

1.1 实验材料
1.1.1 菌种与试剂
裂殖壶菌(Shizochytrium sp.)菌种，海水中分离筛选。

香草醛、无水乙醇、磷酸
等均为分析纯。

1.1.2 培养基
(1)试管固体斜面培养基：葡萄糖15 g/L，蛋白胨 5 g/L，酵母浸粉2 g/L，海水
晶15 g/L，琼脂粉20 g/L，调pH为6.0～7.0。

(2)种子培养基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉5 g/L，海水晶15 g/L，调pH为6.0～7.0。

(3)发酵培养基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，大豆油3 g/L，海水晶15 g/L，调pH为6.0～7.0。

1.1.3 仪器与设备
FBZ1002-UP-P标准试剂型超纯水机；752紫外分光光度计；SBA-40D生物传感分析仪；IE1002电子天平；ZWY-211C恒温振荡器；真空干燥箱；GC-1690气
相色谱仪。

1.2 实验方法
1.2.1 裂殖壶菌的培养
从试管固体斜面培养基中取裂殖壶菌1环，接种于50 mL的种子培养基中，27℃、200 r/min振荡培养24 h后，按照5%比例接种于新鲜的100 mL发酵培养基中，27℃、200 r/min摇床培养 48 h。

1.2.2 菌体湿重测定
吸取10 mL发酵液，3 000 r/min离心10 min，将菌体沉淀用软化水洗涤2次，
离心分离，用吸水纸吸净管口的水分并称重。

1.2.3 发酵液中总油脂的测定
真空干燥法：吸取10 mL发酵液，3 000 r/min离心15 min，反复洗涤离心2次，收集菌体细胞；向其中加入6 mL 4 mol/L的盐酸，旋涡振荡30 min；沸水浴8 min后，立即放入冰箱中冷却静置10 min；再向其中加入16 mL氯仿-甲醇(体积比1∶1)混合液，旋涡振荡混匀，萃取15 min后，3 000 r/min离心15 min，并将氯仿层转入洁净的离心管中，加入8 mL 0.25%的氯化钠溶液，离心后再将氯仿层转入离心管中；然后将合并的氯仿层置于-0.09～-0.1 MPa的真空干燥箱中，在60～70℃条件下烘至恒重，称重。

磷酸香草醛法[16]：吸取发酵液0.5 mL，加入1.5 mL 无菌水洗涤，3 000 r/min 离心15 min，重复2次。

加2 mL无菌水稀释后，振荡均匀，取0.1 mL菌悬液
置于25 mL具塞试管中(蒸馏水为对照样)，加入2 mL 98%的浓H2SO4，沸水浴10 min，常温水浴5 min。

取出具塞试管加入5 mL磷酸香草醛溶液，振荡均匀，37℃水浴15 min，常温水浴10 min，在515 nm 处测吸光值(OD515)。

1.2.4 油脂脂肪酸组成中DHA含量的测定
称取按照1.2.3真空干燥法提取得到的油脂0.04 g(精确至0.000 1 g)于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL十三烷酸甘油三酯内标储备液，加入适量的正庚烷使之溶解，并稀释至刻度，摇匀后，准确吸取2 mL稀释液于10 mL带盖离心管中，加入 0.2 mL 氢氧化钾甲醇溶液(4 mol/L)，剧烈振荡1 min以上，静置10 min。

取上层有机相通过气相色谱仪测定DHA含量[1]。

气相色谱条件：色谱柱，DB-23(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)石英毛细管柱；柱
温升温程序，90℃保持5 min，9℃/min升至240℃保持5 min，3℃/min升至250℃；载气(氮气)流速1.33 mL/min；进样口温度250℃；检测器温度300℃；分流比100∶1；进样量1 μL。

1.2.5 葡萄糖的测定
发酵液中的残糖采用生物传感分析仪测定。

1.2.6 油脂含量标准曲线的绘制
取发酵液100 mL，从中吸取50 mL移入100 mL容量瓶中，并用无菌水定容至刻度；以此类推，配制5个梯度的稀释样品。

按照1.2.3分别用真空干燥法和磷酸香草醛法测定每个样品中的油脂含量(g/L)以及OD515，以油脂含量(g/L)为纵坐标，OD515为横坐标，建立标准曲线。

每个样品至少做2个平行。

2.1 油脂含量的标准曲线方程
按照1.2.6，油脂含量和OD515之间的标准曲线方程为Y=22.529x+0.311 7，相关系数为0.999 3。

说明发酵液中的油脂含量可以通过分光光度计测定515 nm吸光值的方法来计算，可实现发酵过程中油脂含量的实时监测。

2.2 裂殖壶菌产DHA 油脂发酵工艺的优化
2.2.1 不同碳源对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
文献[17]报道裂殖壶菌常用的碳源为葡萄糖和甘油，但每种菌对葡萄糖的利用率不一样。

本实验结合实际生产，分别以不同质量浓度的葡萄糖(30、40、50、60、90 g/L)和30 g/L的甘油以及混合碳源(20 g/L 葡萄糖+10 g/L甘油)为碳源，在共同加入10 g/L酵母浸粉，5 g/L蛋白胨，15 g/L海水晶的基础上，按照1.2.1的方法培养，研究不同碳源对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响。

结果见图1。

由图1可知，随着培养基中葡萄糖质量浓度的增大，菌体湿重不断下降，而
OD515却不断升高，说明碳氮比越高，越抑制菌体生长速度，越刺激细胞中油脂的积累。

同样质量浓度的葡萄糖和甘油相比，甘油对菌体生长和油脂积累效果都最好，30 g/L甘油油脂积累的效果等同于60 g/L葡萄糖的，但是由于甘油的成本远高于葡萄糖，不适合大规模生产，因此选用葡萄糖作为发酵培养基的最佳碳源。

发酵过程中，初始葡萄糖质量浓度采用30 g/L，后期可采用一次性补充葡萄糖或者
降低氮源含量的方法提高培养基中的碳氮比，从而刺激菌体细胞中DHA油脂的积累。

2.2.2 不同氮源对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
氮源主要分为有机氮源和无机氮源。

一般认为，有机氮源比无机氮源营养丰富，更容易被菌体细胞利用；而无机氮源不利于菌体生长，但对次级代谢产物的影响作用明显。

本实验对裂殖壶菌报道[17-18]中常见氮源进行对比，在30 g/L葡萄糖、15 g/L海水晶的基础培养基中按10 g/L的质量浓度分别加入酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆粉、豆粕粉、硝酸钠、硫酸铵以及空白对照(氮源为10 g/L的蛋白胨和5 g/L的酵母浸粉，其他同基础培养基，下同)进行摇床培养48 h后，测定菌体湿重和OD515。

结果见图2。

由图2可知，不同氮源对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响差异较大。

其中菌体生长的较佳氮源有蛋白胨、酵母浸粉及玉米浆粉；而油脂积累的较佳氮源有蛋白胨、玉米浆粉和硝酸钠，而硫酸铵的效果不佳，可能是因为培养基中pH太低，对菌体生长不利，从而影响了油脂的积累。

因此，筛选出蛋白胨、玉米浆粉和硝酸钠作为发酵培养基的较佳氮源。

2.2.2.1 蛋白胨质量浓度对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
在30 g/L葡萄糖、15 g/L海水晶的基础培养基中，分别添加不同质量浓度的蛋白胨(5、10、15、20、30 g/L)进行摇瓶培养，48 h后测定菌体湿重和OD515。

结果见图3。

由图3可知，随着蛋白胨质量浓度的增加，菌体湿重和OD515都呈现先升高后下降的趋势；其中OD515在质量浓度10 g/L时最高，而菌体生长在质量浓度15 g/L时最好。

综合考虑，选择质量浓度10 g/L 的蛋白胨作为最佳。

2.2.2.2 玉米浆粉质量浓度对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
在30 g/L葡萄糖、15 g/L海水晶的基础培养基中，空白对照为10 g/L蛋白胨和
5 g/L酵母浸粉，分别添加不同质量浓度的玉米浆粉(5、10、15、20、25 g/L)进行摇瓶培养，48 h后测定菌体湿重和OD515。

结果见图4。

由图4可知，随着玉米浆粉质量浓度的提高，菌体湿重呈先增加后降低的趋势，说明氮源提高能一定程度上增大裂殖壶菌的生长速率，但玉米浆粉质量浓度过高也会抑制菌体的生长；而OD515最高是在10 g/L的玉米浆粉，说明此时的碳氮比最适合菌体生长和油脂积累，氮源越高，反而会抑制菌体细胞中油脂的积累。

玉米浆粉与空白对照相比，菌体湿重和OD515都相对较低，但是玉米浆粉的成本价格较蛋白胨和酵母浸粉低，因此在实际生产中，优先采用玉米浆粉作为主要氮源，少量添加蛋白胨，既能保证油脂的积累，又不影响菌体的生长。

2.2.2.3 蛋白胨和玉米浆粉组合氮源对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
以30 g/L葡萄糖、15 g/L海水晶为基础培养基，空白对照为10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母浸粉，研究10 g/L氮源总量下玉米浆粉和蛋白胨不同组合氮源对菌体生长和油脂积累的影响。

0、2、4、6、8、10 g/L 代表组合氮源中玉米浆粉的质量浓度。

结果见图5。

由图5可知，随着组合氮源中玉米浆粉质量浓度的不断升高，裂殖壶菌菌体湿重不断提高，即组合氮源对菌体生物量比以蛋白胨为唯一氮源的效果好；而OD515呈先增高后降低的趋势，其中玉米浆粉6 g/L、蛋白胨4 g/L时，油脂积累最好，而且比空白对照高。

因此，选择6 g/L玉米浆粉和4 g/L蛋白胨的组合氮源作为最佳的基础氮源。

2.2.2.4 硝酸钠质量浓度对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
基于以上优化结果，以4 g/L蛋白胨和6 g/L玉米浆粉为基础氮源，采用后期添加硝酸钠的方法刺激油脂的积累。

以30 g/L葡萄糖、15 g/L海水晶为基础培养基，空白对照为10 g/L蛋白胨和5 g/L酵母浸粉，研究不同质量浓度硝酸钠(0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8 g/L)对菌体生长和油脂积累的影响。

结果见图6。

由图6可知，3种氮源按比例组合以后对菌体生长和油脂积累都有一定促进作用。

其中硝酸钠的质量浓度在3.6～3.9 g/L范围内时，裂殖壶菌生长和油脂积累效果
最好。

说明无机氮源和有机氮源的组合，既有菌体生长的速效氮源，又有提供菌体代谢产油脂的迟效氮源，使得在原有发酵水平上不仅降低了生产成本，也将是今后生产优化中提高氮源利用率的趋势所在。

2.2.3 海水晶质量浓度对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
裂殖壶菌作为一种海洋真菌，需要有一定的渗透压来满足生长需求，因此通过添加海水晶来提供裂殖壶菌的渗透压环境。

以30 g/L葡萄糖、6 g/L玉米浆粉、4 g/L 蛋白胨、3.6～3.9 g/L硝酸钠为基础培养基，在培养基中分别添加15、20、25、30、40、50 g/L的海水晶摇瓶培养48 h后，测定菌体湿重和OD515。

结果见图7。

由图7可知，15～50 g/L的海水晶对油脂积累的影响不甚明显，但对裂殖壶菌的菌体生长影响较大，15 g/L的海水晶下，裂殖壶菌的菌体湿重和OD515都较高。

因此，选择15 g/L作为最佳的海水晶质量浓度。

2.2.4 大豆油对裂殖壶菌生长和DHA油脂积累的影响
裂殖壶菌生长和发酵过程中需要通气培养，其中会产生大量泡沫，消泡剂的消泡效果明显，但对菌体生长产生一定的抑制作用，而大豆油等脂类物质也有一定的消泡效果，而且具有提供菌体生长的碳源和生长因子的作用。

因此，本实验选用大豆油(0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 g/L)作为发酵用消泡剂，以30 g/L葡
萄糖、6 g/L玉米浆粉、4 g/L蛋白胨、3.6～3.9 g/L硝酸钠、15 g/L海水晶为基础培养基，研究大豆油的最佳添加质量浓度。

结果见图8。

由图8可知，大豆油对裂殖壶菌生长影响较大，而对油脂积累作用不明显。

其中，在0～3.0 g/L的质量浓度范围内时，随着大豆油质量浓度的提高，菌体湿重也有
所提高，且在3.0 g/L时，菌体湿重最高，说明大豆油不仅可以用来消除发酵过程
中产生的气泡，而且能被菌体生长所利用，从而刺激菌体的生长。

2.3 裂殖壶菌产DHA油脂发酵放大实验
以优化的裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基：葡萄糖30 g/L、玉米浆粉6
g/L、蛋白胨4 g/L、硝酸钠3.6～3.9 g/L、海水晶15 g/L为基础，在50 L的发
酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外，通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长，最终经过72 h的流加培养，菌体湿重达到200
g/L，总油脂含量达到60%以上，通过气相色谱分析油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。

根据生产实际需要，通过磷酸香草醛法实时监测裂殖壶菌的DHA油脂积累情况，对裂殖壶菌的基础发酵工艺进行了优化。

得到适合裂殖壶菌生长和油脂积累的最佳培养基配方为：葡萄糖30 g/L，玉米浆粉6 g/L，蛋白胨4 g/L，硝酸钠3.6～3.9 g/L，海水晶15 g/L；在50 L的发酵罐中采用后期流加一定量的葡萄糖提高碳氮比来提高油脂积累外，通过流加3.0 g/L的大豆油来刺激菌体生长，最终经过72 h 的流加培养，菌体湿重达到200 g/L，总油脂含量达到60%以上，通过气相色
谱分析油脂脂肪酸组成中的DHA含量占22%左右。

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