莲ARF基因家族全基因组鉴定和表达分析

莲ARF基因家族全基因组鉴定和表达分析$
苏静：，王柯阳：，董臣E，周江波B，李兰芝：
(1.湖南农业大学湖南省农业数据分析与决策工程技术研究中心，湖南长沙410128；
2.河南工业学生物工程学院，河南郑州450001&
3.贵州省凯里学院健康学院，贵州凯里556011)
摘要：生长素反应因子(auxin response factor,ARF)是调节生长素表达的转录因子响应基因，与植物生长发育和信号转导等多个过程密切相关。

研究莲ARF基因鉴定，从莲的全基因组中共鉴定到30个ARF基因家族成员。

分析其理化性质发现它们的氨基酸数介于86aa~988aa，等电点 4.61~9.05，大部分表现为酸性且都为亲水蛋白)利用生物信息学软件分析莲的ARF蛋白序列的基序，结果显示莲中不是所有的ARF蛋白都含有B3结构域、Auxin_resp结构域、AUX_IAA结构域，但至少具备其中一种结构域,ARF基因家族中预测含有15个保守基序，对莲ARF分析，莲中ARF蛋白可以被划分为四组，基因结构进化高度保守。

研究结果为后
研究莲ARF基因家族的功能奠定了基础。

关键词：莲；ARF基因家族;基因表达；生分析
中图分类号:Q946.885文献标志码：A文章编号：1672-3872(2020)15-0009-05
0前言
生长素反应因子(auxin response factor,ARF)是一类调节控制生长素应答基因表达的重要的转录因子，植物生长发育和信号转导等多个过程都与它密切相关叽生长素反应因子(ARF)在对生长素信号转导的调控过程中，往往是以家族形式来进行调控的，例如Aux/IAA#GH3#SAUR 基因家族，在调节植物生长和发育方面起着至关重要的作用珥这些基因都有一个共同特点，在基因的启动子区域均含有生长素应答元件的顺式作用元件(TGTCTC)93,其都由6个碱基组成°ARF能够特异地与生长素响应基因启动子区域的生长素响应元件TGTCTC结，制基因的表[4]o因，ARF基因家族对植物的生长发育至关重要。

Ulmasov等95用酵母单杂交的方法首次从拟南芥中分离出ARF，AtARF1以来，对ARF家族的的来多，在拟南芥[6、97#[8；、
[9；、[10；植物中，ARF基因家族都出来，并且有多ARF家族成的些基因能发
定，例如在拟南芥中，ATARF1和ATARF2发生；
对拟南芥的发育造成响，响的
分部位的生长和凋亡。

ATARF3和ATARF4也对植物的生
长发育和生有着重响°ATARF5作用由：
部与组成的维管组织与胚的发育°ATARF8作用于
基金项目：湖南省教育厅科学研究项目“基于全基因组关联和全基因组选择的稻米；质遗传基础剖析”(19A244)；河
南省科技攻关项目“莲藕质地性状相关的候选基因发
N及分子标记开发”(192102110120)；贵州省教育厅
X然科学基金(重\)项目“凯里云谷田园台湾水果小
番茄引种气候适应性综合鉴评"(黔教合KY字[2015]
381)
作者简介：苏静(1997—)，女，湖南长沙人，硕士，研究方向：统计基因组学。

通信作者：(1981—)，女，湖南长沙人，博士，副教授，研究方向：统计基因组学。

根的发育和控制的活动。

这些家族成的不断发ARF家族重要。

，ARF基因家族在莲中的相关。

子生植物，是一用食用的作物，有和，都是，其同的有不同的和药用。

子有，抗和作用，莲花具有止，祛湿消风，心益肾的。

ARF基因家族的能，有调控莲的生长模式以及和果实的发育。

将对的ARF基因家族进行，用生物信息学软件对的全基因组进行比对，的ARF基因，对其理性、基因结构、保守基序和进关进行分析，以期进一步
ARF基因的能有的信息。

1材料和方法
1.1试验材料
在能基因组数据库Lotus-DB(http://lotus-db. /)中下载的全基因组数据及其注释文件°从Pfam数据库(/)中下载ARF基因家族(PF06507)[11]的HMM文件。

1.2莲ARF基因鉴定
使用HMMER 3.0软件(http://hmmer.j /)对莲能基因组数据库中注释基因组序列进行ARF基因的比对搜索，将得到的序列用Pfam和SMART(http://smart.em-bl-heidelberg.de/)数据库进行预测，筛选出含有保守域的序列作为莲的ARF基因家族成°
1.3莲ARF蛋白理化性质分析
利用在线软件ProtParam(/prot-param/)对ARF基因的编码蛋白序列进行分析，预测其相对分子量、电点、不稳数、肪指数、疏性。

1.4莲ARF蛋白保守域和保守基序分析
将莲ARF蛋白序列用多序列比对在软件DNAMAN 中进行分组比对，用在线软件SMART和WebLogo3
(/)分析莲ARF蛋白的保守结构域,为了更进一步分析ARF基因家族在莲中的分布情况，可使用在线软件MEME(/meme/ tools/meme)预测莲ARF蛋白序列的保守基序$
1.5莲ARF家族的系统进化分析
利用进化树分析软件MEGA5.1()，根据NJ近邻方法(执行参数:Poission correction& pairwise deletion和bootstrap,对莲ARF的ARF保守域蛋白序列进行进化树分析$从拟南芥的数据库(http://www. /)中下载了19条拟南芥ARF蛋白,并利用其对莲ARF进行亚组分类。

2结果与分析
2.1莲ARF基因家族的鉴定
在通过FMMER 3.0软件的hmmsearch指令利用ARF结构域FMM文件对莲注释基因组序列进行ARF基因的全基因组序列比对搜索,此时有37个ARF相似基因，再与莲注释基因组序列进行比对找到其各自的序列,通过SMART在线软件对其各自的保守域进行分析，但其中7个无保守域,，最终得到30个莲ARF基因序列,分别命名为LARF1至LARF30。

2.2莲ARF蛋白理化性质分析
对莲的30个ARF蛋白序列进行分析,预测其分子量、&定系数、脂肪指数、疏水性，结如1:示。

其的氨基数分布在86aa~988aa;等电点在4.61~9.05，其中有24个LARF 7,性；6个LARF7,显碱性$此
,LARF蛋白的7,性,在性的亚中用$定指数分析LARF蛋白不稳定指数40,为不稳定蛋白。

亲水性分析表明, LARF基因都是亲水基因。

表1莲ARF基因家族信息表
Gene
B3AuX­
.in res
domain.
domain
Aux-
in_I-
AAdo-
main
蛋白
质长
/aa
等电
点
不稳
定系
数
脂肪
系数
平均亲
水数
LARF1157〜259283〜365737〜869907 6.3256.0573.46-0.470 LARF2121〜223247〜329651〜787831 6.1459.2064.15-0.656 LARF3131〜236260〜342589〜703738 5.8353.4175.20-0.401 LARF4132-247271-353609〜691713 5.8855.6075.36-0.377 LARF5232-334358〜440978 6.1149.4976.75-0.319 LARF6167〜269293〜375691 6.5060.7964.88-0.551 LARF7127〜229253〜336629〜751794 6.0759.0178.44-0.336 LARF8170〜272296〜378763 6.5054.2672.32-0.304 LARF9167〜269293〜375808 6.3155.5473.92-0.475 LARF10133〜235259〜342678〜766809 5.6362.3180.11-0.284 LARF11122〜224291〜374701 6.4948.3173.44-0.372 LARF12127〜229653〜769804 5.8461.8573.56-0.515
Gene
B3
domain
Aux-
inTres
domain
Aux-
inTI-
AAdo-
main
蛋白
质长
/aa
等电
点
不稳
定系
数
脂肪
系数
平均亲
水数LARF13122〜224291〜374704 6.5651.6470.50-0.400 LARF14127〜221245〜372505〜640677 5.7362.8369.81-0.546 LARF15146〜248272〜355804〜921950 5.5352.4078.71-0.375 LARF16185〜287311〜393634〜7617678.2350.4673.77-0.380 LARF17136〜238262〜341557〜640691 5.7256.2070.38-0.550 LARF18129〜231255〜338842〜945988 5.9859.6576.60-0.456 LARF19132〜233257〜336534〜659684 6.2549.0875.20-0.471 LARF2012〜115139〜2213418.9366.3170.91-0.264 LARF21161〜263287〜369623〜7467568.6858.4472.70-0.438 LARF22146〜248272〜355790〜906935 5.4854.3481.96-0.330 LARF23121〜223274〜3573687.0949.8081.01-0.091 LARF24121〜223274〜357599 5.8653.7973.81-0.207 LARF25129〜233754〜852895 5.5554.5476.50-0.443 LARF2629〜1061709.0559.2052.82-0.416 LARF275〜5886 6.5783.4161.16-0.700 LARF2826〜991657.0550.1776.67-0.401 LARF2940〜84100 4.6153.8385.70-0.124 LARF30169〜201202 5.4661.1985.30-0.102 2.3莲ARF基因结构域分析
对莲ARF基因家族的结构域分析,结如1,大部分蛋白有B3结构域、Auxin_resp结构域& AUX_IAA结构域其中两者,分其中一$其中LARF1LARF4、LARF7、LARF14LARF19、LARF21、LARF22,14个蛋白有全3个结构域, LARF5、LARF6、LARF8、LARF9、LARF11、LARF20、LARF23、LARF24,8个候选蛋白只具备B3结构域和Auxin_resp结构域$LARF12&LARF25只具备B3结构域和AUX_IAA结构域$LARF26、LARF27、LARF28、LARF29、LARF30只具备Auxin_resp结构域,LARF19含有两个AUX_IAA结构域$结莲中有的ARF蛋白有B3结构域、Auxin_resp结构域&AUX_IAA结构域，但至少具备其中一结构域$
通过DNAMAN比对和Weblogo对其3个保守结构域进行在线分析，如2,3个结构域在莲中保守，结构域中个基保守的,如中Auxin_resp结构域中的F、
Y、W、P,其中在B3结构域中有32个基在其序列中全保守的,结构域(120aa(的26.7%$Auxin-resp结构域中有6个氨基酸在其序列中是完全保守的，结构域(90aa(的6.7%$AUX_IAA结构域中有8个氨基在其序列中是完全保守的，结构域(148aa(的5.4%$
2.4莲ARF保守基序分析
为了更进一步分析ARF 基因家族在莲中的分布情
况，预测其保守基序,LARF 基因家族中预测含有15个保
守基序，每条蛋白序列上所包含的保守基序的类型和数目
存在一定差异，这些保守基序类型和数目上的差异揭示了
其功能的多样性。

除了 LARF26、LARF27、LARF28、
LARF29#LARF30不含motifl 夕卜，其余均含有motifl 。

motif2 不含 LARF26、LARF27、LARF28、LARF29。

相比于
motif1 与 motif2, 除了 LARF20、LARF26、LARF27、LARF28、
LARF29、LARF30外,其余均含有motif3。

相比于前三者, motif4 出现了 15 次,motif5 出现 26 次,motif6 出现 27 次,
motif7出现25次,motif8出现27次,motif9出现20次, motif10 出现 22 次，motifll 出现 25 次,motif12 出现 28
次,motif13 出现 22 次,motif14 出现 16 次,motif15 出现 16 次，如表2、图3所示。

结果表明，在图中蛋白质序列中出 现次数较高的motif 为有着重要功能的保守基序，十分重 要°其中motifl 、motif2、motif3等分布较为广泛参与到多种
非生物和生物胁迫的调节过程等。

虽然很多基序的功能
暂 ， 与莲的 的分裂分和 、 的
建成、维管组织的成和分、器衰、
、
向性
外界压力等生 相。

2.5莲ARF 基因家族基因结构及系统发育树分析
除 LARF25、LARF26、LARF27、LARF28、LARF29、
b
LARF30 的 25 条 LARF 蛋白 序列 建
,
如图4所示,25个LARF 基因中有11
基因,
分别为 LARF1 和 LARF2,LARF16 和 LARF21 ,LARF17 和
a
图1 莲ARF 基因家族蛋白结构
ftWHAVSTGThfiTVY|l®TSPAEjrvPFCGY.MESVKNNYSI^®B|FffiGgEAPECRFT.STIVGIGD»fiPNMPG§KfficgK AWHAVSTGTlflTV^|mTSPAD|lVPFCGY.MESIKNYYSI^HllRHG|EAPEGRFT.|TIVGIGDA|FCR|PGlmc|K AAHAAANNSPlTinfNPBASPSElVVFLAKYTKAMYT.CVSLGMRlRMMFETEESGVRRYM.GTITGISELDFVRWKNSQliaNlQ 2^AHAJLANNSFlTIF|l«ASFSElviLLSKYNKAMYT.CVSI^MRllATlESGVRR^.|TITGISDllFVR|KwntBQ VA5AVSTKSV|N 工W ^ASCS 斗I VFFRKF.HKSrKLPFS 申■tfl|l ：AAERRYT.卜VTGTND 屮 c |l vanaistrsmihvfxspfaspaeevipygky .vksirhpvsigtpikmrfemeetperrcs .gvvtgmgelcphrwpnskhbclm AAHAAATNSRITIHfNFBASPSEBVIFLSKYVKAVYHTRVSVGMRIRHLFETEESSVRRYM.GTITGISELDPVRWPNSHWRSVK VANAVSSKSV|Hvd|iapTGSEJlIPLCKF.LKSF£GPFSvH||K|milEAAERRYT.|LlAGlSDllpVR|pGl£aBs|L VASAISTRSMIHVHfSPRASPAEBVIPYKKY.VKSIRHFISIGTRIKHKFEMEERAERRCS.GVVTGIGELDPCRWPNSKHHCLM AAHAAATNSRlTIFliNftiASPSEjVITLAKYVKAVYHTRVSVG!!RiR|lSTjESSVRRYH.iTITGISELljpVRilPNSH1lR5^K AflTLAANGCsiEW|Y&ASTPE|CVKfiSAV.KAAMRIGWCE«HK|AHlgrSSRISWFl«TISSVCVfiBpiPiPbSESL|Q AATLAANGCPlEWXYjpilASTPE^VVKASAV.RAflMRICWCSm^Ki!AiaTicSSRISWFl«TISSVCVA|FMPNiEilriUQ fiSHAIATGTLeSVFXKPHTSRSElIISVNKY.LEARNHKLSVGMRIKMRFEGEEAFERRFS.GTIIGVGENASPWWflrTEWRSlK 2kABAAANRSF|TIF|lUACPSElviPLAKYGKAVYGTQVSI^H (ani|ESGKRRyM.lTIIGISDl|PLR|pGSmtlQ ASHAISTGThlsvJlflTNPSEllIPCEQY.MTSVSNLHSI^HB|«s|ECPEGRLA.lTVVGIECA|FVs|pG|EAclK aSHAVATQTL|rvJ™TS . .Q|IISLNKY .L CAVNNGFSV^MiaBK (a£SPERRFT .|TIVGVGD . HSS 屮R lfs|E AAHAAANHSPirvnfNPRASPSEFVIPLAKYYKAVYSNGISLGMRIRMMFETEELGTRRYV.GTITGISCLDFVRWKNSGIiHNLQ ASHAVATCTlllV^fllflTS . .JlISLNKY .LrAANNGFSV^MfaBHG|£SPERRFT .I t IVGVGD .VSS 屮■申K AAHAAANNSPITi™PRASPSKEVIPLSK¥NGAHYT.GVSLGMRCRMMIGTEESGVCKYM.GTITGIS£LDFVRW?：：lS ；WB ：］LC rSHALSTGTllSvjRHTCPSEllVPYCGY . IASISRVY5v |^H r 1k H s |e FPCGSLA .|t VVEVEE i 1f I g |pg |e S c I k MHAAANRSl4TIF|}AACPSElviFLAKYGKAVYGTCVSI^B (aiST|ESGKRRYM.|TITGISCllFLBlpGSKVSllE AflELAGAMRPEEVIYYFRTG3PrFVV?AE7V.EESLMIFW!-!IGMRVKMAVETEESSRMTWFQGTVSSIATPEHGPWKGSFWHMLQ MELAGVNREW|憫AGS P 瑙WKhEAV .E ESLN 1咖\儈艷督才1卜SSRMTW f Q t VSSVAS 卅日G 护g |*M q VGSAHSTKSV|NIl|lflASGSl4lAFFRKF.BKSLNGPFFlM|lllwlYAVERR^T4LAQNGCAYCMVlJ££C ....... .........................EE ......ITFVNG.PFSIGM. . . .7S i A p B t |e AAERRYT .CLVTGINDhf F VB|LG|Eac|L ...SEFFATV1NI.RPHVFCH ......WCVKL .HAEVAMCEVY .A GIEjR^TKEAAERRYT .|LVTGINCIgFVl4F(jE^C|L aaelagvnri |ew |^B agssd |wkaeae .eeslnivck 4e |n ........................................................ VAELARVNR f |ew |4a SSS e |w K. . .E.EESVN .....................................................................
（注：a.B3 结构域；b.Auxin_resp 结构域；c.Auxin_IAA
结构域$ ）
图2莲ARF 蛋白的保守结构域分析
LARF19,LARF11 和 LARF13,LARF23 和 LARF24,LARF4
和 LARF20,LARF18 和 LARF25,LARF15 和 LARF22,
LARF7 和 LARF10,LARF5 和 LARF8,LARF6 和 LARF9,
其中除去LARF4和LARF20这
基因外，其10
基因支持率都等于
于100%。

这 明
构建的
，10 LARF 基因的基因序列相
,
非 。

为一
ARF 基因家族的进化关系，Z 引入了 19个
ARF 基因,与25个 ARF 基因构建
ARF 基因家族
，如图5所示。

的分
支, ARF 基因分成 类,分 为group I # group "、
group # # group $。

其中 group I 有 7 个 LARF 基因，存在 6
个 种 异性分支,group "有4个LARF 基因，
group#有 10 个 LARF 基因,group$有 4 个 LARF 基因。

表2莲ARF 基因家族保守基序的分布情况
基因
Motif
LARF11,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF2
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF31,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF4
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,15LARF5
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14LARF61,2,3,5,6,7,8,10,11,12,13
LARF7
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
续表2
基因
Motif
1,2,3,5,6,7,8,10,11,12,13
1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12,13,15
1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15
LARF11
1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12
LARF121,2,3,4,6,7,8,9,11,12,13,14,15LARF13
1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12
LARF141,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13,14,15
LARF151,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF161,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14
LARF171,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF181,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF19
1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,13,14,15LARF201,2,5,6,8,10,11,12,13
LARF21
1,2,3 ,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15LARF221,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,13,14,15LARF23
1,2,3,5,6,7,8,10,12
LARF241,2,3,5,6,7,8,10,11,12LARF251,2,3,4,6,7,8,9,11,12,13,14,15LARF265,8,11,12,13LARF276,8,12,
LARF286,7,11,12,LARF29
5
LARF30
2,5,10
图4莲ARF 蛋白的系统发育进化树
94
ATARF19
LARF13 ATARF11 ATARF15LARF23LARF24 ATARF10
LARF19ATARF12 ATARF13ATARF14ATARF3ATARF4ATARF5ATARF8ATARF6ATARF7
giwp group !1
groupl\
图3莲中ARF 蛋白保守基序
ATARF18LARF7LARF10
LARF15LARF22LARF18LARF25
grouplll
图5莲与拟南芥ARF
基因家族的系统进化树
3讨论
本研究从莲的全基因组中共鉴定到30个莲ARF基因。

目前已有不少物中的ARF基因鉴定岀来，但是不的物，其ARF基因家族成员数不。

本
验从莲中鉴定30个LARF基因,拟南芥和苹果鉴定到的基因多，与玉米问的31个LARF基因似,少于从大中鉴定的51个和中问的47个。

有
的是，莲的ARF数量与玉米相似，其基因组却远小于玉，莲ARF数大于苹果，其基因组不苹果大。

测，物基因组的大小在决定ARF基因组中的数不性作用。

有因为'不，全鉴定其全的基因。

有测的进步，更多的ARF基因鉴定出来°
ARF基因家族在调节植物和发育方面起着至关重要的作用，物的多。

本
验物方全基因组平上分析了莲ARF 基因，其基因结构、化性质、结构、化了分析，为莲ARF基因的
了一定的数。

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(上接第8页)为0.66MPa,因此，为了保证蜜橘不损伤，其穿刺应力应小于1.46N,穿刺压强应不超过0.46MPa。

3结论
1)测量了南丰蜜橘的三轴尺寸和物料参数，明确了蜜橘的平均质量为35.38g,表皮平均厚度为1.38mm,球形度为88.67%。

2)基于质构仪开展了南丰蜜橘挤压试验,获得了蜜橘表皮损伤的应力应变曲线，其平均挤压应力为35.77N,最小挤压应力为20.60N,最大挤压应力为69.60N,方差结果表明蜜橘表皮挤压应力差异性较大％
3)开展了蜜橘穿刺试验,获得了蜜橘穿刺的应力应变曲线，其平均穿刺应力为2.08N,最小穿刺应力为1.46N,方差结果表明其穿刺压力变化不大，大小范围为1.46N~2.59N O
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