高中生物精品资源第六章第1课时 植物细胞融合课件高中生物竞赛

原生质体制备的一般程序
1）材料选择
原则 (1)原生质体起始材料的特性和生理状况是决定原生质体质量的重 要因素之一。生长旺盛、生命力强的材料 (2)肥水条件、生长季节、植物年龄和光照等都明显地影响原生质 体的产量和活力
具体 （1）试管苗的叶片：叶肉组织（叶片充分展开），叶绿素 （2）实生苗的子叶和下胚轴：消毒，发育同步、生命力和分化能力好 （3）愈伤组织或悬浮细胞：结构疏松、对数生长期。存在变异遗传
B、 酚藏花红（phenosafranine）染色法 无活力的被染成红色 C、 荧光增白剂（calcofluor white, CFW）染色法
CFW 可结合于新合成细胞壁的ß－糖苷上，在400nm激发光照射下可产生 绿色荧光。叶绿素则产生红色荧光
D、伊凡蓝（Evans blue）染色法 只有已受损伤的细胞才能摄取这种染料， 而完整无损的活细胞则不能摄取这种染料
2）酶的种类、浓度及其组合
纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶
pH 5-6
pH 4.7-6.0 T=25-30℃
pH 4-5
3）渗透压和稳定剂
（1）酶液、原生质体洗液和培养基中的渗透压应基本上与原生质体的 等渗或比细胞内的渗透压略高些
（2）在略微高渗透溶液中比在等渗溶液中更为稳定 （3）较高水平的渗透压可以阻止原生质体的破裂和出芽，但也有可能
•1986年，Spangenberg单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。
目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株。 其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高 等植物向低等植物扩展。
原生质体杂交研究的意义
原生质体融合 植物细胞融合的障碍在于细胞壁的阻挡,原生质体可以自发或诱导融合,形成 杂种细胞, 从而克服了有性远缘杂交不亲和性，创造新的种间、属间、科间 杂种类型 (1)创造3新：创造新的遗传变异，新的育种材料，甚至新物种 杂种细胞来自首双亲的核外遗传物质，在杂种的分裂和增值过程中，双亲的 叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组， 从而产生新的核外遗传系统
基本特征
（1）能进行植物细胞的各种基本生命活动： （2）蛋白质和核酸的合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的
物质交换等。
（3）原生质体在诱导条件下能发生融合，在离体培养条件下可再生植株。
3、影响原生质体分离的因素
1）材料 2）酶的种类、浓度及其组合 3）酶液的渗透压 4）酶解时间、温度 5）纯化方法
抑制原生质体的分裂
渗透压调节剂
(0.2-0.8mol/L)
子叶和下胚轴
甘露醇 （mannitol） 愈伤组织
山梨醇 (sorbitol) 胚性悬浮细胞
蔗糖 (sucrose)
葡萄糖 (glucose) 果糖(fructose) 麦芽糖 (amylomaltose) 半乳糖 (galactose) 木糖醇 (xylitol)
4、原生质体培养
材料： 基因型和来源 决定了原生质体离体培养再生植株成功与否， 原生质体培养技术包括：培养基组成、培养方法、培养条件等
1）培养基组成
（1）无机盐 大量元素浓度； NO3－和NH4+的比例； Ca2+浓度(稳定原生质体膜)
（2）渗透压 蔗糖－－甘露醇和山梨醇 葡萄糖－－蔗糖或大量葡萄糖加少量蔗糖 麦芽糖＝＝蔗糖或葡萄糖 随着细胞壁的形成和细胞不断的分裂应不断降低渗透压， 才能促进细胞团的进一步生长和愈伤组织的形成
第6章 植物细胞融合与细胞重组 第1课时 植物细胞融合
一、植物细胞融合
（一）原生质体分离及植株再生
1、原生质体研究进展
•1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 •1960年，Cocking首次应用酶法制备原生质体获得成功。 •1971年，Takebe 首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 •1985年，Fujimura第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。
其他物质的作用
（1）提高膜的稳定性，增加完整 原生质体的数量和活力
CaCl2 , KH2PO4, MES (2-氮 吗啉乙烷磺酸), 葡聚糖硫酸钾
（2）牛血清蛋白可以防止细胞壁降 解过程的纯化
１、沉降法：分子量较小的甘露醇为渗透调节剂。 低速离心，使原生质体沉淀于试管底部
缺点：原生质体数量上损失较多，获得率较低 ３、梯度离心法：利用比重不同的溶液，经离心后使完整无损的原生质
体处于两液相的界面之间，而细胞碎片等杂质沉于管底。 更为纯净的原生质体
5)原生质体活力检测
A、 荧光素双醋酸酯（ＦＤＡ，fluorescein diacetate）染色法 ＦＤＡ本身无荧光，无极性，能自由地穿越完整的细胞质膜。 ＦＤＡ进入原生质体后，受到原生质体内酯酶的作用，分解成有荧光的极 性物质－－荧光素。荧光素不能自由细胞质膜，因而积累在有活力的原生质体 中，当用紫外光照射时，便产生绿色荧光
(2)遗传转化：可作为理想受体系统进行各类遗传操作,它可较容易地摄取
外来的遗传物质。 (3)基础研究：提供了理想的实验体系。体细胞遗传学、细胞生物学、生 理学、病理学、病毒学、分子生物学、育种学等领域的研究
2、原生质体制备
1）原生质体(protoplast)：除去细胞壁的细胞或被质膜所包围的裸露细胞
优点：纯化收集方便，操作简单，原生质体丢失少 缺点：漂洗过程中易造成原生质体的损伤，纯度不够好。
２、漂浮法：分子量相对较大的蔗糖为渗透压调节剂。收集液１０００ ｒ／ｍ离心１０分。原生质体漂浮于溶液的表面。
优点：可获得较为纯净的原生质体，并且可以避免在离心纯化过程 中因震荡撞击或挤压引起的原生质体破裂或损伤，所用试剂简 单，成本低
（3）有机成分 含丰富的有机成分有利于细胞分裂 （4）激素 生长素和分裂素是必需的
原生质体需要适时不断地调整激素的种类和浓度：起始分裂、细 胞团形成、愈伤组织形成、器官或胚状体发生和植株再生等。
2，4-D：对细胞的分裂是必需的。NAA, BA , KT (5) pH 值
培养基的pH一般为5.5-5.9。过高或过低都会对原生质体的活力及 其分裂产生不利的影响