子痫前期胎盘组织mirna差异表达谱生物学分析及mir-365a-3p参与发病的机制探讨

子痫前期胎盘组织ｍｉＲＮＡ差异表达谱生物学分析及ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ参与发病的机制探讨
李晖ꎬ焦顺ꎬ郑晓丹ꎬ肖黎ꎬ陈智芳ꎬ刘荣荆州市中心医院ꎬ湖北荆州４３４０２０
㊀㊀摘要:目的㊀建立子痫前期胎盘组织ｍｉＲＮＡ差异表达谱并对其生物学功能进行分析ꎬ探讨差异表达谱中变化最显著的ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ参与子痫前期发病的相关机制ꎮ方法㊀采用高通量测序技术对子痫前期和正常胎盘组织(各３例份)进行ｍｉＲＮＡ表达谱测序ꎬＤｅＳｅｑ２分析差异表达ꎬ对差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因进行ＧＯ及ＫＥＧＧ功能富集分析ꎮ可视化软件ＳｔａｒＢａｓｅ３.０显示ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ(差异表达谱中表达上调最显著的ｍｉＲＮＡ)与ＴＧＦ￣β通路关键基因ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１的３ᶄ非编码区均存在靶向结合位点ꎮ采用ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ法检测子痫前期和正常胎盘组织(各４１例份)ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ及ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达ꎬ并分析其相关性ꎮ结果㊀与正常胎盘组织相比ꎬ子痫前期胎盘组织中有４４个ｍｉＲＮＡ差异表达ꎬ其中１２个ｍｉＲＮＡ表达显著上调㊁３２个ｍｉＲＮＡ表达显著下调ꎮＧＯ及ＫＥＧＧ富集分析结果显示ꎬ差异表达ｍｉＲＮＡ潜在靶基因主要参与子宫内膜癌㊁ＴＧＦ￣β信号通路㊁Ｗｎｔ信号通路㊁急性粒细胞白血病㊁ｍＴＯＲ信号通路㊁醛固酮调节钠的重吸收㊁慢性粒细胞白血病㊁胰岛素信号通路㊁ＥｒｂＢ信号通路㊁
癌症发生等ꎮ子痫前期胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ相对表达量高于正常胎盘组织ꎬＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ相对表达量均低于正常胎盘组织(Ｐ均<０.０１)ꎮ子痫前期胎盘组织中ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达均呈显著负相关关系(Ｐ均<０.０５)ꎮ结论㊀子痫前期胎盘组织存在异常表达的ｍｉＲＮＡꎬ并参与诸多信号通路ꎻ子痫前期胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ表达升高ꎬ其可能通过负性调控ＴＧＦ￣β信号通路参与子痫前期的发病ꎮ㊀㊀关键词:子痫前期ꎻ微小ＲＮＡꎻ差异表达谱ꎻｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐꎻＴＧＦ￣β通路㊀㊀ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２￣２６６Ｘ.２０２０.１１.００７
㊀㊀中图分类号:Ｒ７１４.２５㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀文章编号:１００２￣２６６Ｘ(２０２０)１１￣００２９￣０５
基金项目:湖北省荆州市科技局科研基金资助项目(２０１７０３５)ꎮ
第一作者简介:李晖(１９８１￣)ꎬ男ꎬ副主任医师ꎬ研究方向为妊娠期高血压疾病及产科出血的治疗ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｌｉｕｒｏｎｇｇ＠１２６.ｃｏｍ通信作者简介:刘荣(１９７３￣)ꎬ女ꎬ副主任医师ꎬ研究方向为妇产科相关疾病的治疗ꎮＥ￣ｍａｉｌ:Ｊａｃｋｉｅ￣６６６６＠１６３.ｃｏｍ
ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｉＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｐｌａｃｅｎｔａｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａａｎｄｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａＬＩＨｕｉꎬＪＩＡＯＳｈｕｎꎬＺＨＥＮＧＸｉａｏｄａｎꎬＸＩＡＯＬｉꎬＣＨＥＮＺｈｉｆａｎｇꎬＬＩＵＲｏｎｇＪｉｎｇｚｈｏｕＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＪｉｎｇｚｈｏｕ４３４０２０ꎬＣｈｉｎａ
㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｐｌａｃｅｎｔａｏｆｐｒｅ￣ｅｃｌａｍｐｓｉａꎬａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐꎬｗｈｉｃｈｉｓｔｈｅｍｏｓｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡꎬｉｎ
ｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀
Ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅｍｉＲＮＡ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｎｏｒｍａｌｐｌａｃｅｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｓ(ｗｉｔｈ３ｃａｓｅｓｉｎｅａｃｈ).ＤｅＳｅｑ２ｗａｓｃｏｎ￣ｄｕｃｔｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓꎬａｎｄＧＯａｎｄＫＥＧＧｆｕｎｃｔｉｏｎｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎｔａｒ￣ｇｅｔｇｅｎｅｓｐｒｅｄｉｃｔｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓ.ＶｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎｓｏｆｔｗａｒｅＳｔａｒＢａｓｅ３.０ｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｔａｒｇｅ￣ｔｅｄｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐａｎｄ３'￣ＵＴＲｓｏｆＳＭＡＤ２ａｎｄＭＡＰＫ１(ｔｈｅｋｅｙｇｅｎｅｓｏｆＴＧＦ￣βｐａｔｈｗａｙ).Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐꎬＳＭＡＤ２ａｎｄＭＡＰＫ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａａｎｄｎｏｒｍａｌｐｌａｃｅｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｓ(ｗｉｔｈ４１ｃａｓｅｓｉｎｅａｃｈ)ꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀
Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍａｌｐｌａｃｅｎｔａｌｔｉｓｓｕｅｓꎬｔｈｅｒｅ
ｗｅｒｅ４４ｍｉＲＮＡｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａꎬａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ１２ｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｄ３２ｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ.ＧＯａｎｄＫＥＧＧｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒ￣ｇｅｔｇｅｎｅｓｏｆｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｉＲＮＡｓｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌｃａｎｃｅｒꎬＴＧＦ￣βｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙꎬＷｎｔｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙꎬａｃｕｔｅｍｙｅｌｏｉｄｌｅｕｋｅｍｉａꎬｍＴＯＲｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙꎬａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｓｏｄｉｕｍｒｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎꎬ
ｃｈｒｏｎｉｃｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓｃｅｌｌｌｅｕｋｅｍｉａꎬｉｎｓｕｌｉｎｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙꎬＥｒｂＢｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙꎬａｎｄｃａｎｃｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｔｈｅｒｅｌａ￣ｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐｉｎｔｈｅｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｐｌａｃｅｎｔａꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘ￣
９
２
ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＭＡＤ２ａｎｄＭＡＰＫ１ｍＲＮＡｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｐｌａｃｅｎｔａ(ａｌｌＰ<０.０１).Ｔｈｅｒｅｗａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｎｅｇ￣ａｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐａｎｄＳＭＡＤ２ａｎｄＭＡＰＫ１ｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａ(ｂｏｔｈＰ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｒｅｉｓａｂｎｏｒｍａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡｓｉｎｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａꎬｗｈｉｃｈｉｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｍａｎｙｓｉｇ￣ｎａｌｐａｔｈｗａｙｓꎻｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐｉｎｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｐｌａｃｅｎｔａｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＴＧＦ￣βｓｉｇｎａｌｐａｔｈｗａｙ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａꎻｍｉｃｒｏＲＮＡꎻｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅꎻｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐꎻＴＧＦ￣βｐａｔｈｗａｙ
㊀㊀子痫前期是一种在妊娠期特发的全身性疾病ꎬ其临床表现为妊娠末３个月㊁分娩过程中或分娩后不久出现高血压㊁蛋白尿及其他系统性疾病ꎬ全世界发病率为３％~８％[１ꎬ２]ꎮ子痫前期的确切病因和发病机制仍不明确ꎬ但已有研究证实子痫前期是由遗传因素和非遗传因素相互作用导致的[３]ꎮ目前研究认为ꎬ滋养细胞侵袭能力减弱所致 螺旋动脉重塑障碍 ㊁ 胎盘浅着床 是子痫前期发病的关键环节[４]ꎮｍｉＲＮＡ具有基因表达调节剂的作用ꎬ具有调控多种细胞侵袭㊁迁移的功能[５~７]ꎮ因此ꎬ我们猜测子痫前期患者胎盘组织中可能存在某种或某些异常表达的ｍｉＲＮＡꎬ这些ｍｉＲＮＡ可能在子痫前期的发生发展中发挥重要作用ꎮ２０１７年１月~２０１８年１２月ꎬ本研究对子痫前期患者胎盘组织ｍｉＲＮＡ表达谱进行鉴定与功能分析ꎬ对差异表达ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ参与子痫前期发病的机制进行探讨ꎮ现报告如下ꎮ１㊀资料与方法
１.１㊀临床资料㊀选取同期荆州市中心医院妇产科行剖宫产分娩的重度子痫前期患者以及正常孕妇各４１例ꎮ重度子痫前期的诊断标准:妊娠２０周后新发高血压ꎬ且收缩压ȡ１６０ｍｍＨｇ或舒张压ȡ１１０ｍｍＨｇꎻ或者伴有明显的蛋白尿ꎻ或出现其他器官受累症状ꎬ如肺水肿㊁肝功异常ꎬ尤其是肝酶异常㊁持续性上腹痛㊁进行性肾损伤㊁视物模糊或头痛等症状ꎮ重度子痫前期患者年龄(３０.２５ʃ１.１２)岁ꎬ分娩时孕周(３６.８９ʃ０.６１)周ꎬＢＭＩ(２７.８３ʃ０.７３)ｋｇ/ｍ２ꎻ正常孕妇年龄(２９.３７ʃ０.８９)岁ꎬ分娩时孕周(３９.３２ʃ０.２２)周ꎬＢＭＩ(２７.２１ʃ０.８８)ｋｇ/ｍ２ꎮ重度子痫前期患者与正常孕妇的一般资料均具有可比性ꎮ本研究通过医院伦理委员会审核ꎬ患者及其家属均签署知情同意书ꎮ
１.２㊀标本处理㊀胎盘经剖宫产分娩方式娩出１ｈ内完成组织采样ꎮ以脐带附着位点为中心ꎬ将胎盘分为四个象限ꎻ在胎盘边缘与脐带附着位点中间㊁母体面与胎儿面间ꎬ避免明显的钙化点㊁大血管及梗死灶ꎻ各象限随机采样ꎬ样本大小约８ｃｍ３ꎬ采样后迅速置于液氮中保存ꎮ
１.３㊀子痫前期胎盘组织ｍｉＲＮＡ差异表达谱的建立及靶基因功能富集分析
１.３.１㊀ｍｉＲＮＡ差异表达谱建立㊀采用高通量测序技术ꎮ随机选取子痫前期及正常胎盘组织各３例份ꎬ充分研磨后ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡꎮ使用ＳｍａｌｌＲＮＡＳａｍｐｌｅＰｒｅＫｉｔ构建文库ꎬ利用ＳｍａｌｌＲＮＡ的５ᶄ及３ᶄ端特殊结构(５ᶄ端有完整的磷酸基团㊁３ᶄ端有羟基)ꎬ以ｔｏｔａｌＲＮＡ为起始样品ꎬ将ＳｍａｌｌＲＮＡ两端加上接头ꎬ反转录合成ｃＤＮＡꎮ经过ＰＣＲ扩增ꎬＰＡＧＥ胶电泳分离目标ＤＮＡ片段ꎬ切胶回收得到ｃＤＮＡ文库ꎮ文库构建完成后ꎬ使用Ｑｕｂｉｔ２.０进行初步定量ꎬ稀释文库至１ｎｇ/μＬꎻ随后使用Ａｇｉｌｅｎｔ２１００对文库的ｉｎｓｅｒｔｓｉｚｅ进行检测ꎬｉｎｓｅｒｔｓｉｚｅ符合预期后ꎬ采用Ｑ￣ＰＣＲ法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>２ｎｍｏｌ/Ｌ)ꎬ以保证文库质量ꎮ库检合格后ꎬ把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求混合后进行ＨｉＳｅｑ测序ꎮ对比分析子痫前期与正常胎盘组织中的差异表达ｍｉＲＮＡꎬ以差异倍数ȡ２且Ｐ<０.０５作为显著上调和显著下调的标准ꎮ１.３.２㊀差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因功能富集分析㊀通过ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ㊁ＰＩＴＡ㊁ｍｉＲＢａｓｅ㊁ｍｉｃｒｏＲＡ.ｏｒｇ㊁ｍｉＲ￣ＴａｒＢａｓｅ㊁ｓｔａｒＢａｓｅ等软件针对差异表达ｍｉＲＮＡ预测可能作用的靶基因ꎬ取交集共获得１９８３个潜在靶基因ꎮ对差异表达ｍｉＲＮＡ潜在的靶基因进行ＧＯ和ＫＥＧＧ功能富集分析ꎮＧＯ富集分析方法:将基因向ＧＯ数据库(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ.ｏｒｇ/)的各ｔｅｒｍ映射ꎬ并计算每个ｔｅｒｍ的基因数ꎬ从而得到具有某个ＧＯ功能的基因列表及基因数目ꎻ应用超几何检验ꎬ找出与整个基因组背景相比ꎬ在基因中显著富集的ＧＯ条目ꎮＫＥＧＧ富集分析方法:以ＫＥＧＧＰａｔｈｗａｙ为单位ꎬ应用超几何检验ꎬ找出与整个基因组背景相比ꎬ在基因中显著富集的Ｐａｔｈｗａｙꎻ通过Ｐａｔｈｗａｙ显著富集确定基因参与的最主要的生化代谢途径和信号转导途径ꎮ
１.４㊀子痫前期与正常胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ表达检测㊀采用ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ法ꎮ选取子痫前期及正常胎盘组织各４１例份ꎬ充分研磨后采用ＴＲＩｚｏｌ法提取总ＲＮＡꎬ逆转录合成ｃＤＮＡꎮＰＣＲ反应体系共２０μＬ:２ˑｍｉＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌＳＹＢＲｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ１０
０３
μＬꎬ正向引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)０.４μＬꎬｍＱＰｒｉｍｅｒＲ(１０μｍｏｌ/Ｌ)０.４μＬꎬｃＤＮＡ模板１００ｎｇꎬ加入ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅｄｄＨ２Ｏ补充至２０μＬꎮＰＣＲ反应条件:９５ħ预变性５ｍｉｎꎬ９５ħ变性１０ｓ㊁６０ħ退火３０ｓꎬ共４０个循环ꎮ实验重复３次ꎬ取平均值ꎮ以Ｕ６为内参ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法计算ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ相对表达量ꎮ
１.５㊀ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＴＧＦ￣β通路关键因子ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１的相互作用分析㊀通过可视化软件ＳｔａｒＢａｓｅ３.０(ｈｔｔｐ://ｓｔａｒｂａｓｅ.ｓｙｓｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ)预测ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ的潜在靶基因ꎮ结果显示ꎬｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１的３ᶄ非编码区均存在靶向结合位点ꎬ证实ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ的潜在靶基因为ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ꎮ见图１ꎮ
图１㊀ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２、ＭＡＰＫ１的
结合位点预测结果
１.６㊀子痫前期与正常胎盘组织ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达检测㊀采用ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ法ꎮ选取子痫前期及正常胎盘组织各４１例份ꎬ充分研磨后采用ＴＲＩｚｏｌ法提取组织总ＲＮＡꎬ逆转录为ｃＤＮＡꎮＳＭＡＤ２上游引物５ᶄ￣ＴＧＴＴＴＴＣＡＧＴＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡ￣３ᶄꎬ下游引物５ᶄ￣ＡＧＣＣＴＣＴＴＧＴＡＴＣＧＡＡＣＣＴＧＣ￣３ᶄꎻＭＡＰＫ１上游引物５ᶄ￣ＴＧＡＣＣＴＣＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡＡＣＣ￣３ᶄꎬ下游引物５ᶄ￣ＧＧＡＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＣＣＴＴＧＧ￣３ᶄꎻＧＡＰＤＨ上游引物５ᶄ￣ＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴ￣３ᶄꎬ下游引物５ᶄ￣ＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣ￣３ᶄꎮＰＣＲ反应体系共２５μＬ:ＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥｘＴａｑ１２.５μＬꎬ上下游引物各１μＬꎬｃＤＮＡ模板２μＬꎬｄｄＨ２Ｏ８.５μＬꎻ反应条件:９５ħ预变性３０ｓꎬ９５ħ变性５ｓ㊁６０ħ退火２０ｓꎬ共４０个循环ꎮ实验重复３次ꎬ取平均值ꎮ以ＧＡＰＤＨ为内参ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法计算ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ相对表达量ꎮ
１.７㊀统计学方法㊀采用ＳＰＳＳ１７.０统计软件ꎮ计量资料以 ｘʃｓ表示ꎬ组间比较采用单因素方差分析及ｔ检验ꎮｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ相对表达量的关系采用Ｓｐｅａｒｍａｎ相关分析ꎮＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ
２㊀结果
２.１㊀子痫前期胎盘组织中ｍｉＲＮＡ差异表达情况㊀与正常胎盘组织相比ꎬ子痫前期胎盘组织中有４４个ｍｉＲＮＡ差异表达ꎬ其中１２个ｍｉＲＮＡ表达显著上调㊁３２个ｍｉＲＮＡ表达显著下调ꎮ前１０位表达上调的ｍｉＲＮＡ分别为ｍｉＲ￣３６５ａ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣１９３ｂ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣
２１０￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣３１９６㊁ｍｉＲ￣６２９￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣２１０￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣１９３ｂ￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣６０８９㊁ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣３６５ｂ￣３ｐꎬ差异倍数分别为４.１３㊁３.８１㊁３.７８㊁３.４２㊁３.１５㊁３.０４㊁２.８１㊁２.６４㊁２.５７㊁２.３６ꎮ前１０位表达下调的ｍｉＲＮＡ分别为ｍｉＲ￣６５２￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣３６１４￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣１３５ｂ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５４５￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５４８ｏ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５８４￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣３７３￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣６５１３￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣２９６￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣８７７￣５ｐꎬ差异倍数分别为６.８８㊁６.４６㊁５.７５㊁５.６３㊁５.２１㊁５.０４㊁４.７３㊁４.５６㊁４.４２㊁３.９５ꎮｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ是差异表达谱中表达上调最显著的ｍｉＲＮＡꎬ选择ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ作为后续研究对象ꎮ
２.２㊀差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因功能富集分析结果㊀ＧＯ富集分析结果表明ꎬ差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因主要参与的分子功能包括ＤＮＡ结合㊁转录调节活性㊁锌离子结合㊁转录阻遏物活性㊁过渡金属离子结合㊁ＲＮＡ结合㊁金属离子结合㊁阳离子结合㊁蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性㊁染色质结合㊁转录因子结合㊁序列特异性ＤＮＡ结合㊁组蛋白甲基转移酶活性等ꎻ参与的细胞组分包括核腔㊁核质部分㊁突触㊁细胞连接㊁细胞器㊁细胞器腔㊁膜封闭腔㊁质膜部分㊁核仁㊁突触部分㊁细胞内非膜细胞器㊁非膜细胞器㊁核外围㊁核基质ꎻ参与的生物过程包括转录调控㊁ＲＮＡ代谢过程调控㊁ＤＮＡ依赖性ＲＮＡ聚合酶Ⅱ启动子转录调控㊁眼睛发育㊁感觉器官发育㊁转录负调控㊁依赖ＤＮＡ㊁磷酸化㊁磷代谢过程㊁磷酸盐代谢过程㊁ｍＲＮＡ代谢过程ꎮＫＥＧＧ富集分析结果表明ꎬ差异表达ｍｉＲＮＡ靶基因主要参与的信号通路包括子宫内膜癌相关信号通路㊁ＴＧＦ￣β信号通路㊁Ｗｎｔ信号通路㊁急性粒细胞白血病相关信号通路㊁ｍＴＯＲ信号通路㊁醛固酮调节钠的重吸收相关信号通路㊁慢性粒细胞白血病相关信号通路㊁胰岛素信号通路㊁ＥｒｂＢ信号通路㊁癌症发生相关信号通路等ꎮ见图２ꎮ２.３㊀子痫前期及正常胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ及ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达比较㊀子痫前期及正常胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ相对表达量分别为１.２６４ʃ０.１９１㊁０.３８６ʃ０.０８４ꎬＳＭＡＤ２ｍＲＮＡ相对表达量分别为１.５３１ʃ０.２８２㊁２.６５８ʃ０.３１９ꎬＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ相对表达量分别为１.５８３ʃ０.２９４㊁２.４２４ʃ０.３０７ꎻ二者比较Ｐ均<０.０１ꎮ
２.４㊀子痫前期胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达的关系㊀子痫前期胎盘组织中ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ相对表达量均呈显著负相关关系(Ｒ２＝０.５３６ꎬＲ２＝０.４２２ꎬＰ均<０.０５)ꎮ见图３ꎮ
１３
㊀㊀
注:Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ为ＧＯ富集分析结果ꎬＤ为ＫＥＧＧ富集分析结果ꎮ
图２㊀差异表达ｍｉＲＮＡ的靶基因ＧＯ及ＫＥＧＧ
富集分析结果
图３㊀ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ与ＳＭＡＤ２、ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达的关系
３㊀讨论
㊀㊀特定器官㊁组织中特异性表达的ｍｉＲＮＡ在人体发育过程中具有关键作用ꎬ而鉴定组织特异性ｍｉＲＮＡ表达谱对探讨疾病发生的病理机制至关重
要ꎮ研究表明ꎬ人胎盘组织中多种ｍｉＲＮＡ与妊娠过程有关ꎬ其表达在妊娠过程中可发生大幅波动[８]ꎮ
Ｊｉａｎｇ等[９]研究表明ꎬ重度子痫前期的孕妇在孕早期血清ｍｉＲ￣５２０ｇ水平升高ꎬ并可通过影响ＭＭＰ￣２翻译来抑制滋养细胞的迁移和侵袭ꎬ且ｍｉＲ￣５２０ｇ可能在有缺陷的螺旋动脉重塑中具有重要作用ꎮＡｄｅｌ等[１０]发现ꎬ与正常妊娠妇女相比ꎬ子痫前期患者胎盘组织中ｍｉＲ￣２１０表达上调ꎬ且ｍｉＲ￣２１０表达升高可导致其靶基因ＰＴＰＮ２ｍＲＮＡ下调ꎬｍｉＲ￣２１０可能参与了子痫前期的发病并与疾病严重程度有关ꎮ因此ꎬ子痫前期胎盘组织中存在某种或某些其他异常表达的ｍｉＲＮＡꎬ在子痫前期的发生发展中发挥重要作用ꎮ
㊀㊀本研究高通量测序及分析结果显示ꎬ与正常胎盘组织相比ꎬ子痫前期胎盘组织中有４４个ｍｉＲＮＡ差异表达ꎬ上调ｍｉＲＮＡ差异倍数前１０位为ｍｉＲ￣
３６５ａ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣１９３ｂ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣２１０￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣３１９６㊁ｍｉＲ￣６２９￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣２１０￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣１９３ｂ￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣６０８９㊁ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣３６５ｂ￣３ｐꎬ下调ｍｉＲＮＡ差异倍数前１０位为ｍｉＲ￣６５２￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣３６１４￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣１３５ｂ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５４５￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５４８ｏ￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣５８４￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣３７３￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣６５１３￣５ｐ㊁ｍｉＲ￣２９６￣３ｐ㊁ｍｉＲ￣８７７￣５ｐꎮ这些差异表达的ｍｉＲＮＡ均具有参与子痫前期发病及预测指标的潜能ꎮｍｉＲＮＡ作为内源性具有调控功能的非编码ＲＮＡꎬ主要通过与靶基因ｍＲＮＡ的３ᶄ非翻译区结合ꎬ调控靶基因表达发挥作用[１１ꎬ１２]ꎮ因此ꎬ本研究通过ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ㊁ＰＩＴＡ㊁ｍｉＲＢａｓｅ㊁ｍｉｃｒｏＲＡ.ｏｒｇ㊁ｍｉＲ￣ＴａｒＢａｓｅ㊁ｓｔａｒＢａｓｅ等软件针对差异表达ｍｉＲＮＡ预测２
３
可能作用的靶基因ꎬ共获得１９８３个潜在靶基因ꎮ对差异表达ｍｉＲＮＡ的潜在靶基因进行功能富集分析ꎬ结果表明其主要参与子宫内膜癌相关信号通路㊁
ＴＧＦ￣β信号通路㊁Ｗｎｔ信号通路㊁急性粒细胞白血病相关信号通路㊁ｍＴＯＲ信号通路㊁醛固酮调节钠的重吸收相关信号通路㊁慢性粒细胞白血病相关信号通路㊁胰岛素信号通路㊁ＥｒｂＢ信号通路㊁癌症发生相关信号通路等ꎮ提示上述异常表达的ｍｉＲＮＡ或可通过某些通路参与子痫前期的发病ꎮ
㊀㊀本研究中ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ是差异表达谱中表达上调最显著的ｍｉＲＮＡꎬ因此选择ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ作为后续研究对象ꎮｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ在多种疾病中发挥重要作用ꎮＬｉ等[１３]研究表明ꎬｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ在喉癌中差异表达ꎬ在喉癌细胞中抑制ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ可以上调ＴＥＴ１表达ꎬ干扰ＴＥＴ１可以消除ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ对细胞增殖㊁周期进程和侵袭的影响ꎮＬｉｕ等[１４]发现ꎬ大脑皮质神经元和原代培养神经元中ＬｎｃＲＮＡＧＡＳ５表达明显高于对照组ꎬ其可通过与ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ竞争性结合调节ＤＣＤＣ２表达ꎬ从而形成ＧＡＳ５/ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ/ＤＣＤＣ２调控网络ꎬ导致大脑皮层神经元凋亡增加ꎮ本研究结果显示ꎬ子痫前期胎盘组织中ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ表达明显高于正常胎盘组织ꎬ通过可视化软件ＳｔａｒＢａｓｅ３.０预测其潜在靶基因为ＴＧＦ￣β通路关键基因ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ꎮ本研究结果显示ꎬ子痫前期胎盘组织中ＳＭＡＤ２㊁ＭＡＰＫ１ｍＲＮＡ表达降低ꎬ二者与ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ表达呈显著负相关关系ꎬ提示ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ可能通过ＴＧＦ￣β通路参与子痫前期的发病ꎮ
㊀㊀综上所述ꎬ子痫前期胎盘组织存在异常表达的ｍｉＲＮＡꎬ并参与诸多信号通路ꎻ子痫前期胎盘组织ｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ表达升高ꎬ其可能通过负性调控ＴＧＦ￣β信号通路参与子痫前期的发病ꎮｍｉＲ￣３６５ａ￣３ｐ有望成为子痫前期的干预靶点ꎬ但仍有待后续细胞和动物实验进行验证ꎮ参考文献:
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(收稿日期:２０１９￣１２￣０５)
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