金鱼核糖体转录间隔区(ITS-1)的克隆和序列分析

金鱼核糖体转录间隔区(ITS-1)的克隆和序列分析
牟希东;白俊杰;汪学杰;罗建仁
【摘要】对金鱼(Carassius auratus)核糖体转录间隔区(ITS-1)进行了克隆测序,并对ITS-1序列进行了分析.结果显示,克隆的金鱼ITS-1区序列长度为294bp,其中A、T、G、C 4种碱基的含量分别为17.0%、14.6%、33.0%、35.4%;与从GenBank 中检索到的12种鱼的核糖体DNA序列比较显示,其与12种鱼的ITS-1序列同源
性较低,在26.0%～61.6%之间;根据金鱼与其他12种鱼的ITS-1序列的同源性构
建进化树,所得的分类结果与传统的分类结果基本一致.
【期刊名称】《淡水渔业》
【年(卷),期】2008(038)001
【总页数】4页(P74-76,43)
【关键词】金鱼(Carassius auratus);核糖体;转录间隔区1(ITS-1);基因克隆;基因序列
【作者】牟希东;白俊杰;汪学杰;罗建仁
【作者单位】中国水产科学院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,中国水
产科学研究院珠江水产研究所,广州,510380;上海水产大学,上海,200090;中国水产
科学院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,中国水产科学研究院珠江水产
研究所,广州,510380;中国水产科学院热带亚热带鱼类选育与养殖重点开放实验室,
中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州,510380;中国水产科学院热带亚热带鱼
类选育与养殖重点开放实验室,中国水产科学研究院珠江水产研究所,广州,510380
【正文语种】中文
【中图分类】Q173
金鱼(Carassius auratus)隶属于鲤形目(Percoiformes)鲤科(Sparidae)鲫属(Carassius)鲫种(Carassius auratus)，是鲫的一个变种[1]。

由于长期以来人工选
育和杂交的缘故，金鱼呈现出丰富的形态性状，分析和了解金鱼的遗传结构对金鱼种质资源的保护和遗传性状的改良具有重要的意义。

核糖体转录间隔区(ITS)介于核糖体DNA(rDNA)的18S和28S之间，长度不大但
进化速率较快，信息含量丰富，已应用于鱼类的遗传学和分类学研究。

Riho等[2]用ITS序列对红点鲑(Salvelinus japonicus Oshima)进行了地理种群的遗传分析，表明ITS序列是适用于这一研究的一个有效片段。

Jousson等[3]将ITS序列用于
北美鲶科25种鱼类的系统发育研究，能够很好地反映种间的系统发生关系。

本研究对金鱼rDNA ITS-1进行了克隆和测序，并将其ITS-1序列和12种鱼类进行了对比分析，旨在了解其核糖体的分子遗传背景，同时为进一步开展金鱼遗传变异的研究提供基础资料。

1 材料与方法
1.1 实验材料
实验鱼为水泡金鱼，由珠江水产研究所观赏鱼基地提供。

EZNA GelExtraction Kit 胶回收试剂盒购自Omega公司，pMD18-T载体质粒购自宝生物(大连)有限公司。

Taq DNA聚合酶、蛋白酶K购自申能博采公司。

1.2 金鱼肝脏总DNA的提取
取肝脏0.1 g，按DNA Extraction Kit介绍的方法提取总DNA，1.0%琼脂糖电泳检测其纯度。

-20 ℃保存备用。

1.3 PCR扩增及其产物的纯化、克隆
参照GenBank中鲤(Cyprinus carpio)、欧鳊(Abramis brama)、红眼鱼(Scardinius erythrophthalmus)等鲤形目鱼类核糖体序列，选择位于ITS-1侧翼的高度保守区(18S和5.8S)，设计金鱼ITS-1区的引物：SF 5′-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3′；SR 5′-CCGAGTGATCCACCGCTAAGAG-3′(由上海博亚生物技术有限公司合成)。

PCR反应总体积为50 μL，其中含有模板DNA 1.25 μL(40～100 ng/μL)，
10×PCR Buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP(10 mmol/L)1.5 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.75 μL，引物(20 pmol/μL)各1 μL，其余为灭菌双蒸水。

扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃延伸7 min。

经电泳法确定目的带。

用EZNA Gel Extraction Kit纯化回收目的带后，与PMD-18T载体进行连接反应，16 ℃水浴2 h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于含Amp的LB平板过夜，挑取白色单菌落，以菌斑为模板，进行PCR扩增，电泳检测并筛选阳性转化子。

1.4 序列测定和分析
选取菌液到上海博亚生物技术有限公司测序；用Mega3.0软件计算碱基含量；并用VectorNTI6.0软件，与从GenBank数据库检索到的7个目12种鱼类的ITS-1序列进行比对，构建系统进化树。

2 结果与分析
2.1 金鱼rDNA ITS-1 序列PCR扩增产物
经PCR产物成功扩增出一条清晰明亮的条带，大小约350 bp，与预期片段大小相符(图1)。

扩增产物经纯化回收后，与T载体连接转化大肠杆菌DH5α。

经酶切鉴定，挑选阳性转化子测序。

图1 金鱼的rDNA ITS-1序列的PCR扩增产物Fig.1 PCR amplified products of
rDNA ITS-1 from goldfish注：1.扩增产物；2.空白对照；M.DL2000 Marker
2.2 测序与序列分析结果
本研究克隆了金鱼核糖体ITS-1全序列(图2)，并将序列登录入GenBank数据库，登录号为EF100727。

金鱼ITS-1序列长度为294bp。

利用Mega3.0软件分析序列的碱基组成为T(14.6%)、C(35.4%)、A(17.0%)、G(33.0%)，G+C含量为
68.4%，明显高于A+T含量(31.6%)；A连续出现的频率较高，最高达到连续出现7个A碱基。

图2 金鱼rDNA ITS-1的核苷酸全序列Fig.2 Complete nucleotide of goldfish rDNA ITS-1
在GenBank中检索到12种鱼类的rDNA ITS-1序列，与金鱼的rDNA ITS-1序
列比对，结果如表1所示，13种鱼类的同源性为26.0%～61.6%。

利用DNA分
析软件VectorNTI6.0构建系统进化树(图3)，所得的分类结果与传统的分类结果
相吻合。

表1 金鱼和其他鱼类的rDNA ITS-1序列同源性、长度和G+C含量比较Tab.1 The homology，length，G+C content of rDNA ITS-1 sequences of goldfish and other fishes种类同源性(%)序列长度(bp)G+C(%)GenBank登录号比目鱼(Platichthys flesus)38.824558.8EC378855褐鳟(Salmo
trutta)26.056862.8AF072862柳叶鱼(Spirinchus
lanceolatus)32.746765.8AB094589丽鲈(Yssichromis
laparogramma)30.452169.2YLU67346东方狐鲣(Sarda ori-
entalis)27.760873.1AB127404青斑河豚(Tetraodon
nigroviridis)34.445677.8AJ270035多刺吸口鲶(Iso-rineloricaria spinosis-
sima)36.339367.2AJ412874大须胡鲶(Clarias
buthupogon)27.055267.5AJ876379大西洋鳕(Gadus
morhua)28.753263.0AY323948欧鳊(Abramis brama)49.634061.5AM183342红眼鱼(Scardinius erythrophthalmus)48.831359.9AM183338鲤(Cyprinus carpio)61.636766AF133089金鱼(Carassius aura-tus)-29466.9EF100727
图3 13种鱼rDNA ITS-1序列构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree derived from rDNA ITS-1 sequences of 13 fishes
3 讨论
通过对13种不同鱼类的rDNA ITS-1序列比对，结果表明不同鱼种间的序列差异很大，同源性很低(在26.0%～61.6%之间)，金鱼与同科的鲤(Cyprinus carpio)同源性最高，也仅为61.6%，这说明ITS-1序列在种间具有高度变异性，可以作为
物种分类及鉴别的分子依据，本研究所得的分类结果与传统的分类结果相吻合也证明了这一点。

比对结果显示，序列长度差异很大，在245～608 bp之间，这主要是由于重复序列导致的。

Hoste等[4]认为大多数重复序列发生在核糖体螺旋内部
或补偿性碱基改变的末端环或凸出部分，而这部分重复序列在核糖体活动中不起关键的作用。

金鱼rDNA ITS-1序列的G+C含量为66.9%，与其他12种鱼类相比
G+C含量相近，没有明显差异。

Torres等[5]认为rDNA ITS-1序列有一个普遍的特性：一般鱼类的G+C含量相似(表1)，高于寄生虫[4]、贝类[6，7]的G+C含量。

Bernardi等[8]和Jansen等[9]认为G+C含量与当地的气候环境有关，高的G+C 含量越易适应热带气候。

关于鱼类的ITS-1功能，一般认为它在rDNA分子成熟剪接过程中起促进作用，
对18S、5.8S与28S核糖体rDNA的折叠有一定的影响[10]，但它在核糖体成熟
时或转录时被切割掉，不参加核糖体的形成[11]。

对于ITS-1序列在不同金鱼品系
中是否存在序列和结构的差异还有待进一步的研究。

参考文献：
[1]王春元．中国金鱼(修订版)[M]．北京：金盾出版社，2000.20.
[2]Riho G，Bernhard G，Reinhard R，et al．Genetic introgression between Arctic charr(Salvelinus alpinus)and brook trout(Salvelinusfontinalis)in Bavarian hatchery stocks inferred from nuclear and mitochondrial DNA markers[J]．Aquacult Int，2004，12(1)：19～32.
[3]Jousson O，Bartoli P，Zaninetti L，et al．Use of the ITS rDNA for elucidation of some life-cycles of Mesometridae(Trematoda
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