优化HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件

优化HPLC测定黑皮鸡枞菌中氨基酸含量样品处理的条件李艳
【摘要】针对不同种类氨基酸采取不同水解方式,优化黑皮鸡枞菌的水解方法,利于高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定样品不同部位氨基酸的组成及含量.通过对黑皮鸡枞菌进行酸水解、碱水解和过甲酸氧化法处理,并进行正交试验优化酸水解的条件,以2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)为柱前衍生剂,反相高效液相色谱法检测黑皮鸡枞菌菌伞、菌柄及子实体中的氨基酸组成.结果表明:当HCl浓度为6 mol/L、加量4 mL、110℃水解24 h时可获得较优的水解效果.采用HPLC检测两个地区产的黑皮鸡枞菌子实体和菌伞、菌柄中,3种水解方法结合处理的水解液,均检出21种氨基酸,总量分别为21.51％、23.68％;菌伞比菌柄中氨基酸含量约高1.28倍.3种水解方法结合处理样品可更全面的检测黑皮鸡枞菌中的氨基酸.
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2018(039)019
【总页数】6页(P147-152)
【关键词】黑皮鸡枞菌;样品处理;氨基酸含量;高效液相色谱法
【作者】李艳
【作者单位】河北科技大学生物科学与工程学院,河北石家庄050018;河北省发酵工程技术研究中心,河北石家庄050018
【正文语种】中文
黑皮鸡枞菌（Termitomyces spp.）属于担子菌纲，伞菌目，侧耳科，鸡枞菌属，是珍贵的野生食用菌，全世界约有25种，我国有19种，主要生长在云南、四川、贵州等地[1]。

自然界中鸡枞菌只能生长在白蚁巢穴上，白蚁菌圃中含有丰富的氨
基酸等营养活性物质[2-3]，与白蚁共生的野生鸡枞菌同样营养丰富，尤其蛋白质
的含量较高，蛋白质中含有丰富的氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸种类齐全[4-5]。

同时，与白蚁的复杂共生关系使人工栽培的鸡枞菌与野生鸡枞菌存在或多
或少的差异。

近年，鸡枞菌的人工栽培技术趋于成熟，研究人工栽培鸡枞菌中氨基酸的组成对于评价人工栽培鸡枞菌技术具有重要的指导意义。

氨基酸是鸡枞菌中重要的营养物质，目前对食用菌中氨基酸的测定主要通过对样品进行酸水解处理，再通过氨基酸分析仪检测[1-2，6]。

在酸性水解中，HCl是最通用的水解剂，但是酸水解过程中会不同程度的破坏半胱氨酸、丝氨酸和酪氨酸，并完全破坏色氨酸[7-8]。

氨基酸分析仪检测存在成本高，专属性强，普及率低等问
题对实际操作造成诸多不便[9-10]。

本研究通过正交试验优化酸水解条件[11]，结合碱水解[12]和过甲酸氧化法[9]，对河北省灵寿县和北京地区栽培的黑皮鸡枞菌
进行水解处理，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定和分析两个地区产黑皮鸡枞菌中不同部位的氨基酸组成，为黑皮鸡枞菌选择性进行深加工产品的开发奠定基础。

1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
新鲜黑皮鸡枞菌（Termitomyces spp.）：分别由河北灵济食用菌有限公司和北
京金珠满江农业有限公司提供。

将鸡枞菌子实体的菌伞、菌柄分离后分别切成细丝状，置于鼓风干燥箱中55℃干燥至恒重，粉碎，过40目筛，备用。

天门冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、羟基脯氨酸（Hyp）、天冬酰胺（Asn）、
谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、
胱氨酸（Cys-S）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨
酸（Phe）、组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、赖氨酸（Lys）和酪氨酸（Tyr）：美国 sigma公司，纯度均≥98%；色谱级甲醇和乙腈：湖北杜文化工科技有限公司；2，4-二硝基氟苯：艾科化学试剂公司；磷酸二氢钾、无水乙酸钠、冰乙酸、三乙胺、硼砂、硼酸、氢氧化钠均为分析纯；试验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器
DWF-100型电动植物粉碎机：河北省黄骅县科研机械厂；101-0AB型电热鼓风
干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；Waters 2695高效液相色谱仪配有Wa
ters 2695分离单元，2996型二极管阵列检测器：沃特斯科技（上海）有限公司；Hypersil ODS2色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大连依利特分析仪器有限公司。

2 方法
2.1 主要溶液的配制
pH 9.0硼酸缓冲溶液：配制0.05 mol/L的硼砂溶液和0.2 mol/L的硼酸溶液，按照体积比4∶1混合均匀。

pH 7.0磷酸缓冲溶液：称取1.7 g磷酸二氢钾固体，加水溶解，转入500 mL容
量瓶中，加入72.75 mL的0.1 mol/L的氢氧化钠溶液，定容后摇匀。

衍生试剂的配制：准确量取0.5 mL的2，4-二硝基氟苯，用乙腈定容至50 mL。

氨基酸标品的制备：称取0.05 g氨基酸标品用pH 9.0硼酸缓冲溶液定容至10 mL，得到5 mg/mL氨基酸标品母液。

取氨基酸标品母液各0.5 mL于25 mL容
量瓶中，用pH 9.0硼酸缓冲溶液定容，得到100 μg/mL氨基酸对照品混标溶液。

过甲酸溶液：将30%的过氧化氢与88%甲酸按照体积比1∶9均匀混合，于室温
下放置1 h后置于冰水浴中冷却30 min，用时现配。

2.2 样品处理
对于不同种类的氨基酸，试验中采用3种水解方法对其进行预处理，其中酸水解
法适用于大部分氨基酸的水解，碱水解法适用于色氨酸分析，而过甲酸氧化法则适用于胱氨酸测定。

2.2.1 酸水解法
参考GB/T 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》中样品的
处理方法，在以HCl浓度（mol/L）、HCl加入量（mL）、水解温度（℃）、水
解时间（h）为影响因素的最佳单因素试验数据基础上，设计L9（34）正交试验。

因素水平表见表1。

表1 酸水解正交试验因素水平表Table 1 Table of acid hydrolysis orthogonal test factor level水平水解时间/h 1 4 2 100 20因素HCl浓度/（mol/L）HCl加
入量/mL水解温度/℃2 110 24 3 8 6 120 28 6 4
2.2.2 碱水解法
精确称取黑皮鸡枞菌粉25 mg（精确到0.000 1 g），置于10 mL水解管内，加
入5 mol/L NaOH溶液6 mL，氮吹仪吹氮气15 min后迅速封管；放入烘箱中110℃水解24 h；将水解后样品从水解管中转入蒸发皿中，并用水多次洗涤水解瓶，洗液一并转入蒸发皿，80℃水浴蒸干；用pH 9.0硼酸缓冲溶液分别多次洗涤蒸发皿，洗液转入50 mL容量瓶中，pH 9.0硼酸缓冲溶液定容；用0.45 μm微
孔滤膜过滤，备用。

2.2.3 过甲酸氧化法
过甲酸氧化法借鉴于淑新等在高效液相色谱-柱前衍生化法测定饲料中的含硫氨基
酸中应用的方法[9]。

2.3 氨基酸柱前衍生法
采用2，4-二硝基氟苯为柱前衍生试剂。

取0.5 mL氨基酸混标溶液至5 mL棕色
容量瓶中，分别加入NaHCO3缓冲溶液和2，4-二硝基氟苯各0.5 mL，放入60℃水浴中，暗处反应60 min。

取出后避光冷却至室温，用pH 7.0磷酸缓冲溶液定
容至5.0 mL，静置15 min，取10 μL 进样分析[13]。

2.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS2色谱柱250 mm×4.6 mm，5μm；流动相A：称取
3.56g无水乙酸钠，溶于1 000 mL水中，加入0.1%三乙胺，用冰醋酸调节pH 6.4。

流动相 B：50%乙腈水；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：
23 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序：0～20 min，30%～36%B；20 min～
26 min，36%～55%B；26 min～41 min，55%～65%；41 min～46 min，65%～90%B；46 min～48 min，90%～98%B；48 min～54 min，98%～
30%B[13]。

2.5 数据处理
色谱分析采用仪器自带Waters-Empower软件。

所有线性方程、重复性和准确性试验数据均由Excel 2010计算得出。

正交试验数据采用Minitab 15进行方差分析。

所有试验进行3组平行。

3 结果与分析
3.1 氨基酸标准曲线的建立
取氨基酸对照品混标溶液，配制成10、20、50、80、100μg/mL的氨基酸标准液，各水平进行3次重复，以峰面积为纵坐标，以氨基酸浓度为横坐标建立标准
曲线方程，R2均大于0.999，氨基酸的标准曲线方程见表2。

表2 氨基酸的标准曲线方程Table 2 The standard curve equation of amino acids序号氨基酸种类标准曲线方程 R2 1 天冬氨酸（Asp） y=7 925x+17 906.6 0.999 9 2 谷氨酸（Glu） y=7 006.5x+7 005.8 0.999 9 3 羟基脯氨酸
（Hyp） y=6 908.1x+7 022.8 0.999 9 4 天冬酰胺（Asn） y=7 839.9x+9 324.3 0.999 9 5 谷氨酰胺（Gln） y=11 318.6x+10 842.2 1 6 丝氨酸（Ser）
y=1 897.2x-1 762.2 0.999 8 7 精氨酸（Arg） y=13 895.4x+44 748.7 0.999 9 8 甘氨酸（Gly） y=2 149.4x-1 421.4 0.999 7 9 苏氨酸（Thr） y=13
936.9x+12 946 1 10 脯氨酸（Pro） y=7 317.8x+8 443.7 0.999 9 11 丙氨酸（Ala） y=12 125.5x+12 749.1 0.999 9 12 缬氨酸（Val） y=9 021.2x+11 168.7 0.999 9 13 蛋氨酸（Met） y=7 067.3x+8 563.7 0.999 9 14 胱氨酸（Cys-Cys） y=9 994.7x+18 428 0.999 9 15 异亮氨酸（Ile） y=8 240.2x+9 951.1 1 16 亮氨酸（Leu） y=7 618.8x+78 597.2 0.999 7 17 色氨酸（Trp）
y=4 218.9x+15 734.5 1 18 苯丙氨酸（Phe） y=3 107.7x+14 808 0.999 9 19 组氨酸（His） y=8 038.8x-51 928.4 1 20 半胱氨酸（Cys） y=7 754.6x-46 188 0.999 8 21 赖氨酸（Lys） y=10 035.6x-2.591 8 0.999 9 22 酪氨酸（Tyr）y=4 736.9x-5 479.6 0.999 2
3.2 酸水解优化结果
按照2.2.1中的方法进行试验，正交试验结果和方差分析分别见表3和表4。

表3 黑皮鸡枞菌酸水解正交试验结果Table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.试验号 HCl浓度/（mol/L）HCl加入量/mL水解温度/℃水解时间/h 结果/%1 4 2 100 20 17.5 2 4 4 110 24 19.1 3 4 6 120 28 17.8
续表3 黑皮鸡枞菌酸水解正交试验结果Continue table 3 Results of acid hydrolysis orthogonal test in Termitomyces spp.试验号 HCl浓度/（mol/L）HCl加入量/mL水解温度/℃水解时间/h 结果/%4 6 2 110 28 19.2 5 6 4 120 20 20.1 6 6 6 100 24 18.8 7 8 2 120 24 18.1 8 8 4 100 28 18.2 9 8 6 110 20 18.1 K1 19.533 19.533 19.500 19.633 K2 20.700 20.367 20.100 20.100 K3 19.167
19.400 19.700 19.567 R 1.533 0.967 0.600 0.533最优组合 A2B2C2D2
表4 黑皮鸡枞菌酸水解正交试验方差分析表Table 4 Table of the variance analysis for acid hydrolysis orthogonal experimental in Termitomyces spp.
水解时间/h自由度 2 2 2 2 Seq SS 6.000 33 3.243 3 1.390 0 0.243 3 Adj MS 3.001 7 1.621 7 0.695 0 0.121 7 F 31.23 16.87 7.23 1.27 P 0.000 0.001 1.27 0.328 S=0.310 018 R-Sq=92.64% R-Sq（调整）=89.09%项目 HCl浓度/
（mol/L）HCl加入量/mL水解温度/℃
由表3和表4可看出，所筛选的4个试验条件对结果的影响因素大小为HCl浓度
＞HCl加入量＞水解温度＞水解时间。

其中HCl浓度和HCl加入量对于结果有极
显著影响，水解温度、水解时间对于试验结果影响不显著。

正交试验中最优组合为A2B2C2D2。

正交试验中第5组，即HCl浓度为6mol/L、HCl加量为4 mL、水解温度120℃、水解时间20 h时测得的氨基酸总量最高，为20.1%。

但是，第5组并不是最优组合的结果，按照正交试验中的最优组合，即HCl浓度为6 mol/L、HCl加量为4 mL、水解温度110℃、水解时间24 h为条件进行验证试验[14]，水解后氨基酸总量达20.5%，因此确定为试验的最优条件，后续对不同批次黑皮鸡
枞菌中的氨基酸含量进行测定时均采用该条件。

3.3 黑皮鸡枞菌中氨基酸含量的测定
以优化后的酸水解方案配合碱水解和过甲酸氧化法，对河北省灵寿县和北京两个产地栽培的黑皮鸡枞菌中的氨基酸含量进行测定，样品分为子实体、菌伞和菌柄，结果见表5。

表5 不同地区黑皮鸡枞菌菌柄、菌伞和子实体中氨基酸含量及组成Table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore
of Termitomyces spp.in two different area氨基酸种类河北省灵寿县（干重%）北京市（干重%）菌柄菌伞完整菌菌柄菌伞完整菌赖氨酸 *（Lys） 1.12 1.32
1.32 1.22 1.57 1.34色氨酸 *（Trp） 0.30 0.29 0.23 0.24 0.39 0.40组氨酸 **（His） 4.27 5.08 4.54 5.36 5.75 5.06天冬酰胺（Asn） 0.07 0.15 0.15 0.08 0.08 0.08丝氨酸（Ser） 0.37 0.59 0.29 0.41 0.47 0.47精氨酸（Arg） 0.6 0.74 0.59 0.49 0.63 0.55脯氨酸（Pro） 0.52 0.59 0.59 0.49 0.63 0.55丙氨酸 #（Ala） 1.27 1.25 1.17 0.98 1.10 1.11酪氨酸（Tyr） 1.05 1.03 0.88 0.98 1.02 1.03胱氨酸（Cys-Cys） 0.52 0.52 0.51 0.49 0.63 0.63半胱氨酸（Cys） 0.22 0.22 0.22 0.24 0.24 0.24缬氨酸 *（Val） 0.75 0.88 0.73 0.73 0.94 0.87异亮氨酸 *（Ile） 0.52 0.66 0.59 0.57 0.71 0.63亮氨酸 *（Leu） 0.37 0.66 0.44 0.41 0.79 0.63苯丙氨酸 *（Phe） 1.95 4.86 3.51 3.17 5.83 4.19苏氨酸 *（Thr）0.75 0.96 0.88 0.73 1.02 0.87蛋氨酸 *（Met） 0.07 0.07 0.07 - 0.16 0.08天冬氨酸 #（Asp） 1.20 1.25 1.24 1.38 1.57 1.42谷氨酸 #（Glu）
2.70 2.87 2.78 2.68 2.83 2.69
由表5可以看出，在两个地区所栽培的黑皮鸡枞菌中均检测出除甘氨酸外21种氨基酸，邹立扣[1]和施渺筱[6]分别对四川省和贵州省野生鸡枞菌进行氨基酸测定，均含有甘氨酸，这可能是人工栽培黑皮鸡枞菌与野生鸡枞菌存在的差异性。

灵寿县栽培的黑皮鸡枞菌氨基酸总量稍低于北京地区产品，分别为21.51%和23.68%，说明存在地域差异。

黑皮鸡枞菌的不同部位氨基酸含量也存在差异，菌伞中的氨基酸含量方差分析表几乎均高于菌柄，且菌伞中氨基酸总量均高出1.27倍左右，这与其他研究鸡枞菌氨基酸测定的结果相一致[1，11]。

本试验测定的完整菌子实体指的是不将菌伞、菌柄分离，直接切成丝状、干燥、粉碎、过筛的样品，所测定各种氨基酸含量应在菌伞、菌柄之间，但是表5中，菌子实体的赖氨酸、色氨酸、组氨酸等几个氨基酸的含量略有偏差，但是均比较接近，这可能是由于样品处理过程中的试验误差造成的。

续表5 不同地区黑皮鸡枞菌菌柄、菌伞和子实体中氨基酸含量及组成Continue
table 5 The content and composition of amino acids in pileus，stipe and sporophore of Termitomyces spp.in two different area注：“*”表示人体8
种必需氨基酸；“**”表示婴儿必需氨基酸；“#”表示鲜味氨基酸；“-”表示未检出。

氨基酸种类河北省灵寿县（干重%）北京市（干重%）菌柄菌伞完整菌
菌柄菌伞完整菌羟基脯氨酸（Hyp） 0.07 0.07 0.07 0.08 0.08 0.08谷氨酰胺（Gln） 0.67 0.74 0.73 0.73 0.79 0.75必需氨基酸总量（essential amino acid，EAA） 5.83 9.70 7.77 7.07 11.41 9.01非必需氨基酸总量（onessential amino acid，NEAA） 13.53 15.1 13.76 14.39 15.82 14.66鲜味氨基酸总量（flavor amino acids，FAA） 5.17 5.37 5.19 5.04 5.50 5.22氨基酸总量（total amino acid，TAA） 19.40 24.80 21.51 21.45 27.24 23.68 EAA/TAA（%） 30.05 39.11 36.12 32.96 41.89 38.05 EAA/NEAA 0.43 0.64 0.56 0.33 0.72 0.61
灵寿县和北京市栽培黑皮鸡枞菌中均检测到的21种氨基酸中，包含8种人体必需氨基酸、1种婴儿必需氨基酸和3种鲜味氨基酸。

8种人体必需氨基酸的总量分别为7.77%和9.01%，分别占氨基酸总量的36.12%和38.05%；组氨酸是婴儿必需氨基酸，其含量分别为4.54%和5.06%，达到氨基酸总量的21.11%和21.37%；3种鲜味氨基酸指谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸，它们的总量分别为5.19%和
5.22%，分别占氨基酸总量的24.13%和22.04%。

相对于已有报道的食用菌中氨
基酸含量的检测结果，无论从氨基酸种类还是含量上来说，黑皮鸡枞菌都是一种具有竞争优势的高氨基酸营养价值的食用菌[15-16]。

Kwang Jae Lee等[17]测定了
茶树菇及其他食用菌中的氨基酸组成与含量，由于只采用了酸水解法对样品进行处理，均未检测到色氨酸和胱氨酸，并且所测定食用菌中必需氨基酸的总量均小于3%，氨基酸总量均小于6%；高燕红等[18]对6种食用菌中氨基酸与蛋白质进行
了分析，其中姬松茸中的氨基酸总量最高，达到25.07%，其次为冬菇，氨基酸总量为15.96%，云耳、银耳等其他4种食用菌的氨基酸总量均在10%以下，远低
于本试验所测黑皮鸡枞菌中氨基酸的总量，这充分说明这两个地区人工栽培的黑皮鸡枞菌氨基酸种类和含量丰富，营养价值高。

灵寿县和北京市人工栽培的黑皮鸡枞菌中粗蛋白含量分别是35.33%和42.13%，氨基酸总量分别占其粗蛋白含量的60.88%和56.21%，必需氨基酸与总氨基酸比值（essential amino acid/total amino acid，EAA/TAA）分别为36.12%、38.05%，必需氨基酸与非必需氨基酸比值（essential amino acid/nonessential amino acid，EAA/NEAA）分别为56%和61%，与联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐的理想蛋白质模式
EAA/TAA为40%和EAA/NEAA为0.6接近[19]。

因此，黑皮鸡枞菌中氨基酸的模式与人体所需氨基酸模式相似，是一种适合人体吸收的优质蛋白质来源。

所测黑皮鸡枞菌中含量较高的氨基酸是组氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸和天冬氨酸，组氨酸在婴儿体内不能自己合成，是婴儿必需氨基酸，苯丙氨酸和赖氨酸属于人体所需8种必需氨基酸，谷氨酸和天冬氨酸是对鲜味有影响的特征氨基酸。

由此可以看出，黑皮鸡枞菌具有较高的营养价值和开发价值。

本研究采用了3种水解法检测黑皮鸡枞菌中的氨基酸，共检测出21种氨基酸，目前研究中对鸡枞菌氨基酸的检测主要集中在以酸水解为主，用氨基酸分析仪检测，酸水解并不能够全面检测出氨基酸的种类。

如施渺筱等[4]在黔产鸡枞菌中检测出的氨基酸16种；张灵芝等[19]在云南产鸡枞菌中检测出17种氨基酸；邹立扣等[1]在四川省生长的10种鸡枞菌中检测出17种氨基酸。

因此，本试验所建立的鸡枞菌水解处理的方法是可行可靠的。

4 结论
研究采用了酸水解法、碱水解法和过甲酸氧化法分别对灵寿县和北京市栽培的新鲜黑皮鸡枞菌进行3种方法水解，并对酸水解条件进行正交试优化，结果显示在
HCl浓度为6 mol/L、HCl加入量为4 mL、水解温度110℃、水解时间24 h为
水解条件时，能够获得较高的氨基酸含量。

对3种方法水解后的水解液以2，4-二硝基氟苯作为柱前衍生剂进行HPLC法检测，共测出21种氨基酸，北京市所产黑皮鸡枞菌氨基酸含量稍高于灵寿县，菌伞中氨基酸含量高于菌柄中。

黑皮鸡枞菌氨基酸EAA/TAA、EAA/NEAA表明其蛋白质属于优质蛋白质。

通过3种水解方法
结合处理样品可以更全面的检测鸡枞菌中的氨基酸，为后续对鸡枞菌乃至其他食用菌类氨基酸的研究提供了理论支撑。

对子实体、菌伞和菌柄分别测定对于后续有选择性的进行深加工产品开发具有指导意义。

参考文献：
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