生物实验： dna连接与转化

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1、ＤＮＡ分子的体外连接
▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的。
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连接反应中值得注意的几个问题：
▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似。
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Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
▪ Ｔ４连接酶作用分三步：
▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。
▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。
▪ 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前 主要有两种假说： １．局部原生质体化假说 －－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮ Ａ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。
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制备感受态细胞
▪ 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合.
▪ ＤＮＡ分子转化分以下几步: ▪ １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ▪ ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受
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5.连接反应的检测
▪ 连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。
▪ 我们下面的实验从粘性末端为例操作。
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▪ 二、实验试剂 ▪ １．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ▪ ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer ▪ 200mM Tris-HCl(pH7.6) ▪ 50mM MgCl2 ▪ 50mM 二硫苄糖醇 ▪ 500μl/ml BSA ▪ ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ▪ ４．5mM ATP
▪ １．简述Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机理。 ▪ ２．简述一个完整外源ＤＮＡ的克隆过程。 ▪ ３．连接反应中应注意些什么问题及如何提
高连接效率。
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2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
▪ 一．实验目的及背景
▪ 体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组 质粒，选用转化和筛选技术， 可获得含重组的阳性 克隆。在此阳性克隆中，ＤＮＡ可在生物体系中大 量扩增，繁殖， 保存以及表达目的基因的产物，这 是ＰＣＲ体外扩增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮ Ａ重组技术，所获得的，不同目的需要的阳性菌株 已广泛应用于科研，医药生产和生物发酵等领域。
▪ Ｔ４ＤＮＡ连接酶
0.1Weiss
▪ 5mM ATP
1μl
▪ ２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
▪ ３．１２℃下过夜连接反应。
▪ ４．反应结束后于－２０℃保存。
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四．结果与分析
▪ 电泳检查连接结果 ▪ １．如何判断连接效果的成功性？
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问题与讨论：
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四．结果与分析讨论
▪ １．计算转化率。 ▪ ２．根据转化率和阴性对照分析实验结果。 ▪ 问题与讨论： ▪ １．根据本实验认为影响转化率的因素有哪
些？
▪ ２．抗性法筛选和互补筛选原理是什么？
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问题解答?
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三．实验方法
▪ ＤＮＡ分子的体外连接
▪ １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
▪ a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
▪ b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新退火的粘端解链， 将 混合物冷却到０℃。
▪ c. 加入：
▪ １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl
▪ 重组子的筛选方法常用的有两种方法：
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１．抗生素筛选法
▪ 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有 该抗性基因（如氨苄青霉素， 卡拉霉素等） 这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基 上长出。
▪ 本实验利用抗生筛选转化子。
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２互补法
▪ 现在使用的许多载体（如ＰＵＣ系列）有含有一个大肠杆菌 ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的 调控序列和头１４６个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一 个多克隆位点。
▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
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4.碱性磷酸酶处理质粒载体
▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图。
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二、转化
▪ １．在1.5ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细 胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上３ ０分钟。
▪ ２．于４２℃水浴９０秒。
▪ ３．冰浴２分钟。
▪ ４．加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分 钟。
▪ ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来.
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2.连接反应的温度
▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳
定，折衷方法是１２℃过夜。
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3. DNA的平未端和粘性末端
▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。
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二、实验试剂
▪ ＬＢ培养基 ▪ 质粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受体菌 ▪ CaCl2 0.1M ▪ Amp
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三．实验方法
▪ 一、感受态细胞制备 ▪ １．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，３７℃培养１６～２０小时。 ▪ ２．挑取单菌落转入２０ｍｌ ＬＢ培养基锥瓶中，３７℃振荡过夜。 ▪ ３．从中取２ｍｌ菌液转入５０ｍｌ ＬＢ培养基中３７℃振荡培养４－
DNA的连接与转化
1.ＤＮＡ分子的体外连接
2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
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一．实验目的及背景
▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。
▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
体菌，另一条降解； ▪ ３． 自稳－－外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成
双链； ▪ ４．表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂，
转录翻译。
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2.重组子的筛选
▪ 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则 上要注意：
▪ １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌 株；
▪ ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原 则而定。
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本实验由二个方面组成:
▪ 1. 质粒ＤＮＡ转化大肠杆菌。 ▪ 质粒转化不同细菌有不同的转化效率，转化
效率的高低与实验的成败直接相关， 通常转 化效率可达１０５－１０７转化子/μg DNA。 ▪ 获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备。
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▪ 所谓感受态， 就是细菌吸收转化因子的生理 状态。
５小时， 测ＯＤ１００达０．４～０．５。 ▪ ４．培养物于冰上１０分钟。 ▪ ５．转入－５０ｍｌ离心管，于４０００ｒｐｍ下４℃离心１０分钟。 ▪ ６．弃上清，倒置离心管１分钟，流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷
的 0. 1mol/L CaCl2，置冰上１０分钟。 ▪ ７．4,000rpm 4℃离心１０分钟，弃上清。 ▪ ８．加入2ml，0.1M CaCl2悬浮细胞，于４℃过夜。
▪ 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。当外源基 因插入时，二者溶为一体后，有β－半乳糖苷酶表达， 在生 色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（xgal）培养基中形成兰色菌落。
▪ 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而 使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重 组子和非重组子。