芝麻香型白酒酒醅中游离氨基酸分析方法探讨

芝麻香型白酒酒醅中游离氨基酸分析方法探讨
孙洁;李好转;孙立臻;郭学凤;王云鹏
【摘要】用离子色谱-积分脉冲安培检测器分离并测定芝麻白酒酒醅中常见氨基酸的方法,以探讨多粮及大曲在发酵过程中蛋白质转化氨基酸,再由氨基酸转化为芝麻香型白酒微量香味成分的反应机理.该方法无需衍生,简便、快速、灵敏度高,适用于酒醅中游离氨基酸的测定.
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】3页(P93-95)
【关键词】白酒;氨基酸;离子色谱;积分脉冲安培检测器;芝麻香型酒醅
【作者】孙洁;李好转;孙立臻;郭学凤;王云鹏
【作者单位】山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119;山东景芝酒业股份有限公司,山东景芝262119
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.3;TS261.7;O657.75;TS261.4
芝麻香型白酒是以芝麻香为主体，是我国现有十一大白酒香型之一。

其生产工艺要点：高氮配料、高温堆积、高温发酵、长期贮存，即“三高一长”的特点。

目前，
高氮配料已为全国芝麻香型白酒行业广泛应用，其中的蛋白质经蛋白酶水解，可形成氨基酸，为美拉德反应的进行提供了物质基础。

其反应产物中的含氮化合物，尤其是吡嗪类（焙烤香）、呋喃类（甜香）、含硫化合物（葱香）对芝麻香型白酒呈香呈味具有重要作用。

用离子色谱分析芝麻香型白酒在不同时期酒醅中游离氨基酸的变化规律，进一步探讨芝麻香白酒微量香气成分的形成途径和机理。

通过工艺调整及微生物强化应用，提高酒体中的主要风味化合物含量，对提高优质酒生产率具有重要意义。

长期以来，由于氨基酸的特殊性，其定量技术成为深入研究的难点。

目前，氨基酸的分析方法有柱前衍生高效液相色谱法、柱后衍生高效阳离子交换色谱法、毛细管电泳法等。

由于大部分氨基酸分子结构中没有发色团，上述方法均需进行衍生化处理，但衍生法通常有操作繁琐、衍生不完全、衍生产物不稳定以及过量的衍生试剂干扰后续测定等问题。

离子色谱-积分脉冲安培法是一种新的氨基酸分析方法，此方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位,可在贵金属(金、铂)电极表面发生氧化反应,从而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离和积分脉冲安培分析。

该方法无需衍生、操作简单、灵敏度高、干扰少且重现性好。

1 材料与方法
1.1 材料、试剂及仪器
酒醅：分别取堆积24 h，入池2 d、入池7 d、出池等时间点的芝麻香型酒醅500 g。

主要试剂：去离子水（电阻率≥18 MΩ）；17种常见氨基酸(生化级标准，天津博纳尔科技有限公司)；乙酸钠(DIONEX)≥99.9%；氢氧化钠 (Fisher Scientific)50%（w/w）水溶液，离子色谱洗脱液；高纯氮气≥99.999%。

仪器设备：美国Dionex ICS-5000多功能离子色谱仪，SP配有双泵单元、EG淋
洗液发生器单元、DC检测器/色谱单元、AS-DV自动进样器单元。

双泵单元中包
含1个单元泵和1个四元梯度泵，其中，四元梯度泵主要用于氨基酸的分析；检
测器/色谱单元中放置进样阀、分析柱和脉冲和积分安培检测器，温度均设为30℃，脉冲和积分安培检测器用金工作电极，pH/Ag/AgCl参比电极。

Chromeleon 6.8色谱工作站，具有强大的数据采集和处理功能；进口超纯水机（Merck Millipore）。

1.2 实验方法
1.2.1 溶液制备
标准溶液的配制：17种常见氨基酸标准储备液浓度约为2.5mmol/L，用氨基酸标准储备液配制成匹配的氨基酸标准溶液。

淋洗液的配制：0.25 mol/L NaOH溶液的配制：量取990 mL去离子水于2 L塑
料淋洗液瓶中，然后快速吸取13.1 mL 50%(w/w)的NaOH浓溶液于盛水的塑料
淋洗液瓶。

l mol/L NaAc溶液的配制：称取82.0 g固体NaAc，用去离子水溶解后稀释到1 L容量瓶中，用0.45 μm水系滤膜过滤并转移至2 L塑料淋洗液瓶中。

淋洗液配制完成后立即充入高纯氮进行保护，以防止淋洗液吸收空气中二氧化碳，以及其中的微生物生长。

1.2.2 色谱条件
色谱柱：AminoPac PAl0阴离子交换柱，包括分析柱(250 minx2mm i.d)和保护
柱(50mmx2mm i.d)。

柱温为30℃。

实验中A通道为去离子水，B通道为0.25 mol/L NaOH溶液，C通道为l mol/L NaAc溶液。

淋洗条件：采用梯度洗脱，A、B、C 3个通道按照一定比例和程序(见表1)进行混合，得到所需要的淋洗液。

淋洗液流速为0.25 mL/min，进样体积25 μL。

电化
学检测器的检测波形为Amino Acids(pH，Ag，AgCl Referen)。

表1 分析氨基酸的梯度淋洗条件时间(min）水分(%）NaOH浓度(0.25 mol/L）NaAc浓度(1 mol/L） Curve 0 76 24 — 5 8 64 36 — 8 18 40 20 40 8 21 44
16 40 5 23 14 16 70 8 42 14 16 70 8 42.1 20 80 0 8 44.2 76 24 0 5 74 76 24
0 5
1.2.3 样品前处理
准确称取新鲜酒醅5.0 g放入研钵中，加入50 mL蒸馏水溶解，并用玻璃棒捣研；将上清液小心移入100 mL容量瓶中，沉渣部分再加入10～20 mL蒸馏水，如此捣研3～4次全部移入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度，摇匀；用 Cleanert
IC-RP柱过滤，弃去最初滤液约20 mL，收集其他滤液供测定用，取滤液10 mL，离心10 min，取上清液，用0.22 μm的水系膜过滤，直接进样分析。

1.2.4 标准曲线
取合适量的氨基酸标准储备液，用超纯水配制成合适的氨基酸标准溶液，色谱条件同上，直接进样得标准曲线。

1.2.5 回收率的测定
通过添加近等量的标准品，计算所得的回收率。

2 结果与讨论
2.1 氨基酸的色谱分离程度
测定17种氨基酸标样色谱图见图1。

从图1可看出，17种氨基酸在以上特定的
分离条件下可以达到很好的分离效果。

图1 17种氨基酸标准溶液的色谱图
2.2 氨基酸的回收率
根据以上分离条件，对氨基酸的混合标样进行检测，分析了各种氨基酸的回收率,
所得的数据见表2。

表2 氨基酸的回收率化合物相关系数加入量(?mol/L）实测值(?mol/L）回收率(%）精氨酸 0.9989 5.00 4.93 99.0赖氨酸 0.9952 5.00 5.05 99.6丙氨酸 0.9991 5.00 5.13 103.0苏氨酸 0.9993 5.00 5.07 102.0甘氨酸 0.9995 5.00 5.13 101.6缬氨酸 0.9997 5.00 5.13 103.0丝氨酸 0.9982 5.00 5.06 101.8脯氨酸 0.9963 5.00 5.12 100.8异亮氨酸 0.9985 5.00 5.24 103.6亮氨酸 0.9990 5.00 5.34 105.8蛋氨酸 0.9993 5.00 5.12 101.6组氨酸 0.9981 5.00 5.08 102.6苯丙氨酸0.9998 5.00 4.94 98.0谷氨酸 0.9985 5.00 5.03 104.0天冬氨酸 0.9999 5.00 5.01 101.6胱氨酸 0.9969 2.50 2.51 101.2酪氨酸 0.9975 5.00 5.00 101.2
由表2可知，通过对17种氨基酸相关系数来看，线性良好；较高的回收率，说明了用该方法检测酒醅中氨基酸所得到的数据是准确可靠的。

2.3 酒醅中游离氨基酸的分析
从芝麻香型白酒中的发酵池中选取了堆积24 h、入池2 d、发酵7 d、出池等时间点的酒醅经前处理后，直接进样进行检测，以保留时间定性、外标法定量，所得到的样品图谱见图2。

图2 酒醅中游离氨基酸分析色谱图
2.4 酒醅中游离氨基酸的含量测定
酒醅中游离氨基酸含量变化分析结果见表3。

高氮配料、高温堆积、高温发酵是芝麻香型白酒工艺中独特的工艺。

在这个过程发生的变化，会形成芝麻香型白酒一些独特的风味物质。

发酵过程中酒醅中的氨基酸类物质的变化结果见表3。

由表3可以看出，苏氨酸有所下降，谷氨酸的含量略有上升，在整个发酵过程中，酒醅中的亮氨酸和异亮氨酸的含量减少最为明显，造成这些现象的原因有待于进一步分析。

表3 酒醅中游离氨基酸的含量变化（mg/kg）样品堆积24 h 入池2 d 发酵7 d 出池苏氨酸 271.32 324.87 107.70 ND甘氨酸 92.25 60.38 76.13 128.25缬氨酸
ND 11.7 14.63 19.31丝氨酸 17.85 15.23 9.98 ND异亮氨酸 1181.62 1051.93 525.31 14.41亮氨酸 126.42 102.18 36.03 ND组氨酸 13.18 11.63 6.98 5.43苯丙氨酸 2.48 1.65 4.13 6.60谷氨酸 ND 13.97 18.38 35.28天冬氨酸 137.66 131.67 121.03 101.75
3 结语
氨基酸是形成芝麻香型白酒风味成分的基础物质之一，用离子色谱-积分脉冲安培
检测器分离并测定芝麻香白酒酒醅中常见氨基酸的方法，以探讨多粮及大曲在发酵过程中蛋白质转化氨基酸，再由氨基酸转化为芝麻香型白酒微量香味成分的反应机理。

实验证明，该方法无需衍生，简便、快速、灵敏度高，适用于酒醅中游离氨基酸的的测定。

参考文献：
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