InDel分子标记WC656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5VS纯合易位中的应用

麦类作物学报 2023,43(9):1115-1124
J o u r n a l o
fT r i t i c e a eC r o p s d o i :10.7606/j
.i s s n .1009-1041.2023.09.04网络出版时间:2023-07-07
网络出版地址:h t t p
s ://k n s .c n k i .n e t /k c m s 2/d e t a i l /61.1359.S .20230707.0905.004.h t m l I n D e l 分子标记W C 656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5V S 纯合易位中的应用
收稿日期:2022-10-02 修回日期:2022-11-25
基金项目:江苏省农业科技自主创新资金项目[C X (19)1001];江苏省重点研发计划(现代农业)项目(B E 2018350
)第一作者E -m a i l :798326530@q q .c o m (郭江涛);L y
d 0527@126.c o m (吕远大,与第一作者同等贡献)通讯作者:杨学明(E -m a i l :x m y a n g @j
a a s .a c .c n )郭江涛1,吕远大2,赵姝楠3,周淼平1,姚金保1,杨学明1
(1.江苏省农业科学院粮食作物研究所/江苏省农业生物学重点实验室,江苏南京210014;2.
江苏省农业科学院卓越创新中心,江苏南京210014;3.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室,江苏南京210095
)摘 要:簇毛麦是小麦品种改良重要的遗传资源,其5V S 上含有硬度基因D i n a /D i n b ㊁
抗白粉病基因P m 55和抗条锈病基因Y r 5V ,创制普通小麦-簇毛麦5V S 易位系新种质,对于高效利用5V S 上的有益基因进行小麦品种遗传改良具有重要意义㊂为了便于鉴别普通小麦-簇毛麦5V S 纯合易位,本研究以m I n D e l 软件分析普通小麦中国春基因组序列,开发了小麦第5同源群短臂的I n D e l 特异分子标记W C 656,对小麦品种以及普通小麦-簇毛麦5V S .5A L 和5V S .5D L 易位系及其衍生后代进行P C R 扩增,根据扩增片段大小来区分5A S ㊁5B S ㊁5D S 染色体臂以及5V S 易位系㊂结果表明,在21个普通小麦品种㊁小麦-簇毛麦5V S 回交F 2代中杂合易位单株,均扩增出379b p (5A S )㊁471b p (5B S )㊁422b p (5D S )3条带㊂在T 5V S .5A L 高代品系㊁回交F 2代中纯合易位单株扩增出471b p (5B S )㊁422b p (5D S )2条带,379b p (5A S )条带缺失㊂T 5V S .5D L 高代品系㊁回交F 2代中纯合易位单株扩增出379b p (5A S )㊁471b p (5B S )2条带,422b p (5D S )条带缺失㊂W C 656鉴别的5V S 纯合易位结果与顺序F I S H -G I S H 分析结果一致㊂T 5V S .5A L ㊁T 5V S .5D L 具有抗白粉病㊁
籽粒硬度指数低等优良特性㊂因此,利用I n D e l 分子标记W C 656可以鉴别普通小麦-簇毛麦T 5V S .5A L ㊁T 5V S .5D L 衍生后代中的纯合易位,P C R 扩增实验操作相对简便,可以为分子标记辅助选育携有5V S 纯合易位的软质弱筋小麦提供帮助㊂
关键词:小麦;簇毛麦;5V S 纯合易位;I n D e l 分子标记
中图分类号:S 512.1;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2023)09-1115-10
D e v e l o p m e n t o f I n s e r t i o n -D e l e t i o nM o l e c u l a rM a r k e rW C 656a n d I t sA p p
l i c a t i o n i n I d e n t i f y i n g W h e a t -D a s y p y r u mv i l l o s a 5V SH o m o z y g
o u sT r a n s l o c a t i o n G U OJ i a n g t a o 1,L ÜY u a n d a 2,Z H A OS h u n a n 3,Z H O U M i a o p i n g 1,Y A OJ i n b a o 1,Y A N GX u e m i n g
1
(1.I n s t i t u t e o f F o o dC r o p s /J i a n g s uP r o v i n c i a lK e y L a b o r a t o r y o fA g r o b i o l o g y ,J i a n g s uA c a d e m y o fA g
r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,N a n j i n g ,J i a n g s u210014,C h i n a ;2.E x c e l l e n c e a n d I n n o v a t i o nC e n t e r ,J i a n g s uA c a d e m y o fA g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,N a n j i n g ,J i a n g s u210014,C h i n a ;3.S t a t eK e y L a b o r a t o r y o fC r o p G e n e t i c s a n dG e r m p l a s m E n h a n c e m e n t ,N a n j i n g A g
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s u210095,C h i n a )A b s t r a c t :D a s y p y
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r o v e m e n t .P r e v i o u s s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t D .v i l l o s u m c h r o m o s o m e a r m5V S c o n f e r s g e n e s i n c l u -d i n gg r a i nh a r d n e s s g e n e D i n a /D i n b ,p o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c e g e n e P m 55a n d y e l l o wr u s t r e s i s t -a n c e g e n e Y r 5V .I t i s o f g r e a t s i g n i f i c a n c e t o c r e a t e T r i t i c u ma e s t i v u m -D .v i l l o s u m 5V Sh o m o z y g
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n e s eS p r i n g r e f e r e n c e g e n o m e.I nt h i ss t u d y,m a r k e r W C656w a s f i n a l l y u s e dt od i s c r i m i n a t e5A S, 5B S,a n d5D So fw h e a t c h r o m o s o m e a c c o r d i n g t o t h e f r a g m e n t s i z e379b p,471b p a n d422b p o f P C R a m p l i f i c a t i o nd e t e c t e d o n a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s,r e s p e c t i v e l y.T h r e e b a n d s s p e c i f i c t o5A S,5B S, a n d5D Sw e r e d e t e c t e d i n21c o mm o nw h e a t c u l t i v a r s a n dw h e a t-D.v i l l o s u m5V Sh e t e r o z y g o u s t r a n s-l o c a t i o no f t w oB C4F2i n d i v i d u a l s.T h eb a n d s s p e c i f i c t o5B Sa n d5D Sw e r e a l s od e t e c t e d i nh o m o z y-g o u s t r a n s l o c a t i o nT5V S.5A Lo f B C4F2i n d i v i d u a l s a n d a d v a n c e d l i n e s,a n d t h eb a n do f5A Sw a s a b-s e n t.S i m i l a r l y,t h e b a n d s s p e c i f i c t o5A S a n d5B Sw e r e d e t e c t e d i nh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o nT5V S. 5D Lo f B C4F2i n d i v i d u a l s a n d a d v a n c e d l i n e s,a n d t h eb a n do f5D Sw a s a b s e n t.T h e s e q u e n t i a l F I S H a n dG I S Ha n a l y s e s f u r t h e r c o n f i r m e d t h e r e s u l t sb a s e do n m o l e c u l a rm a r k e r W C656.C o n s e q u e n t l y, w h e a t-D.v i l l o s u m5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o nc a nb e i d e n t i f i e de f f i c i e n t l y b y m a r k e r W C656i n t h i s s t u d y.T5V S.5A La n dT5V S.5D Ls h o w e dh i g h e r r e s i s t a n c e t o p o w d e r y m i l d e w,a n d s i g n i f i c a n t-l y l o w e r g r a i nh a r d n e s s i n d e x c o m p a r e d t o t h e i r r e c u r r e n t p a r e n t s.T h eP C R p r o d u c t s c a nb e d e t e c t e d b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s,a n d t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e s s i s r e l a t i v e l y e f f i c i e n t.I tw i l l b e h e l p f u l t o e x p e d i t em a r k e r-a s s i s t e ds e l e c t i o ni ns o f ta n d w e a k g l u t e n w h e a tb r e e d i n gp r o g r a m w i t h w h e a t-D. v i l l o s u m5V S.5A La n d5V S.5D Lt r a n s l o c a t i o n l i n e s a s t h e p a r e n t.
K e y w o r d s:W h e a t;D a s y p y r u mv i l l o s u m;5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n;I n D e lm o l e c u l a rm a r k e r
小麦是我国重要粮食作物,其安全生产对我国粮食安全具有重要意义㊂优质高产多抗高效新品种选育与配套生产技术推广应用,使小麦单产大幅度提高㊂在小麦品种遗传改良中,培育突破性品种往往与突破性种质的挖掘和应用密切相关㊂20世纪60年代,矮秆基因的利用使小麦品种株高降低,单产大幅度提高[1]㊂小麦近缘物种
蕴含丰富的有益基因,已成为小麦品种改良的重要基因资源,如黑麦含有锈病和白粉病抗性基因[2-4];长穗偃麦草不仅抗旱㊁抗寒能力很强,而且抗小麦白粉病㊁锈病㊁条纹花叶病㊁黄矮病㊁赤霉病等多种病害[5-7];簇毛麦高抗锈病㊁白粉病,对眼斑病㊁全蚀病㊁梭条花叶病等具有较好的抗性,同时具有籽粒硬度低等优良性状[8-17]㊂通过远缘杂交,可以将来自于近缘属种的优异基因转移给小麦,创制附加系㊁代换系和易位系等异染色体系[18]㊂与抗锈病和白粉病相关的小麦-黑麦T1R S.1B L㊁小麦-簇毛麦T6V S.6A L等易位系种质的创制与应用,已培育出许多抗病高产的小麦品种[19-23]㊂
簇毛麦5V染色体短臂上含有抗白粉病基因P m55㊁抗条锈病基因Y r5V和籽粒硬度基因D i-n a/D i n b等有益基因[17,24],南京农业大学细胞遗传研究所通过染色体工程技术创制了普通小麦-簇毛麦5V添加系㊁5V代换系和5V S易位系㊂其中,创制的普通小麦-簇毛麦5V S.5A L㊁5V S.5D L 易位系,为进一步高效利用5V S上的有益基因进行品种改良奠定了物质基础㊂目前,鉴定普通小麦背景中簇毛麦染色体的主要方法包括基因组原位杂交(g e n o m i c i n s i t u h y b r i d i z a t i o n,G I S H)㊁荧光原位杂交(f l u o r e s c e n c e i ns i t u h y b r i d i z a t i o n, F I S H)㊁分子标记等[25-30]㊂利用原位杂交方法可
以分析普通小麦背景下簇毛麦染色体的大小及变异类型,但实验操作相对繁琐㊁费时,开发应用簇毛麦染色体或染色体臂特异分子标记,可以显著提高普通小麦-簇毛麦异染色体系的鉴定效率㊂
为了利用分子标记鉴别簇毛麦5V S染色体臂,曹亚萍等[31]根据水稻㊁小麦的E S T序列,开发了可追踪簇毛麦5V S染色体的S T S引物C I-N A U411-745㊂Z h a n g等[32]利用普通小麦7个部分同源群上的276对S S R标记引物对普通小麦中国春㊁簇毛麦和中国春-簇毛麦二体附加系的基因组D N A进行扩增分析,筛选出可用来追踪簇毛麦5V S染色体的引物w m c233㊂利用中国春与簇毛麦间扩增出多态性的597对小麦E S T引物,对亲本及普通小麦-簇毛麦二体附加系进行扩增分析,获得具有簇毛麦5V S特异条带的标记2个,其中C I N A U211-700(该标记亦称为5E S T-237[33])标记引物可以扩增出5V S㊁5A S㊁5B S㊁5D S条带[34]㊂付必胜等[35]通过簇毛麦5V S的基因组序列信息与中国春小麦染色体5A S㊁5B S㊁5D S上的基因进行比对,开发了具有簇毛麦5V S 特异条带的保守直系同源基因序列(C O S)标记引
㊃6111㊃麦类作物学报第43卷
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物59对㊂上述已开发的标记中,标记C I-N A U411-745㊁w m c233,只能检测5V S特异条带;付必胜等[35]开发的59对C O S标记中,19个只能检测5V S特异条带,40个为3种类型的共显性标记,可以区分5V S与5A S㊁5B S㊁5D S中1~3个条带,条带大小之间最大差异为20b p,P C R扩增产物需经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测㊂C I-N A U211-700标记可以同时区分5V S㊁5A S㊁5B S㊁5D S条带,但其扩增产物也需经聚丙烯酰胺凝经胶电泳检测㊂
本研究利用普通小麦中国春基因组序列,通过m I n D e l软件开发小麦第5同源群短臂的I n-D e l共显性分子标记,其扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,检测第5同源群短臂特异条带是否缺失,快速㊁简便地筛选出普通小麦-簇毛麦5V S.5A L㊁5V S.5D L易位系为供体亲本的分离后代中5V S纯合易位单株,为利用普通小麦-簇毛麦5V S易位系进行种质创制和品种改良提供新的分子标记㊂1材料与方法
1.1试验材料
普通小麦-簇毛麦T5V S.5A L易位系z r q5V-2㊁T5V S.5D L易位系N A U415-2,含有簇毛麦5V S染色体臂;普通小麦中国春,21个长江中下游冬麦区推广的小麦品种(宁麦9号㊁宁麦13㊁宁麦18㊁扬麦13㊁扬麦15㊁扬麦20㊁宁紫麦1号㊁扬麦16㊁扬麦25㊁扬麦29㊁扬辐麦4号㊁镇麦168㊁镇麦9号㊁镇麦10号㊁镇麦12㊁泰麦901㊁华麦1092㊁盐麦1号㊁农麦88㊁瑞华麦596㊁宁麦资166),这些材料均不含有5V S染色体臂,用于分子标记的开发验证㊂94个z r q5V-2/4*宁麦9号B C4F2单株及B C4F2ʒ3家系,180个宁麦13*4/N A U415-2 B C4F2单株及B C4F2ʒ3家系,这些材料用于标记的验证与筛选㊂17个T5V S.5D L和5个T5V S. 5A L高代品系,用于标记的应用检测㊂z r q5V-2 (N A U421衍生系)㊁N A U415-2由南京农业大学细胞遗传研究所创制[17,24],中国春㊁小麦品种由江苏省农业科学院粮食作物研究所收集保存㊂z r q5V-2/4*宁麦9号㊁宁麦13*4/N A U415-2B C4F2群体及B C4F2ʒ3家系,T5V S.5A L㊁T5V S.5D L高代品系,由江苏省农业科学院粮食作物研究所创制和保存㊂1.2试验方法
1.2.1标记引物W C656序列
通过m I n D e l软件[36]分析普通小麦中国春参考基因组序列(版本:I WG S C R e f S e q v2.1,h t-t p s://w h e a t-u r g i.v e r s a i l l e s.i n r a.f r/S e q-R e p o s i-t o r y/A s s e m b l i e s),在第5同源群短臂开发出265对I n D e l标记引物,其中W C656标记用于本研究,该标记引物对为W C656-F:5'-G A G C A C-C A G C A G A G C A A G A T G-3'和W C656-R:5'-A C-
C A A C A G C A C C T A G A C A A C A C-3'㊂
1.2.2分子标记检测
利用植物基因组D N A提取试剂盒(K a r r o-t e nK2304)提取试验小麦材料的叶片D N A㊂分子标记检测采用B i o-R a dC1000扩增仪,P C R反应体系为20μL,其中D N A模板1μL(浓度40 n g㊃L-1),引物W C656-F㊁W C656-R各1μL(浓度10μm o l㊃L-1),2ˑT a q P l u s M a s t e r M i xⅡ(V a z y m e)10.0μL,d d H2O7μL㊂P C R反应循环程序为:94ħ预变性3m i n,94ħ变性30s,62ħ退火45s,72ħ延伸70s,34个循环;72ħ延伸10m i n㊂P C R产物以1%的琼脂糖凝胶(含体积比1ʒ10000的T a n o n核酸染料)电泳,电泳电压100V,电泳时间1.5h,以凝胶成像系统(T a n o n 3500)扫描成像并存入计算机㊂
1.2.3细胞遗传学分析
根尖细胞有丝分裂中期染色体制片,参照C h e n等[37]的方法并作修改㊂在22ħ培养箱中,小麦种子在垫有滤纸的培养皿中用水浸泡24h,露白后转到4ħ冰箱中处理22~24h,再转到22ħ培养至根长1~2c m,剪取根尖置于一氧化二氮(N2O)中处理2h,再将处理过的根尖用90%冰醋酸固定10m i n后,取出放于70%乙醇中保存㊂制片时,将固定的根尖用45%醋酸解离10 m i n,然后切取少许根尖生长点组织压片,相差显微镜下预检㊂取染色体分散良好的制片用液氮处理,揭片后用70%㊁90%和100%乙醇梯度脱水,气干后用于原位杂交㊂
荧光原位杂交的寡核苷酸探针套包括12个寡核苷酸探针,其序列组成参照C h e n等[37]㊂所用寡核苷酸探针套包括p A s1-1㊁p A s1-3㊁p A s1-4㊁p A s1-6㊁A F A-3㊁A F A-4㊁p S c119.2-1㊁G r a s s-5S-1㊁G r a s s-5S-2㊁(G A A)10㊁B S C L135-1㊁B S C L135-2,其中(G A A)10㊁B S C L135-1㊁B S C L135-2为F AM修饰,其余探针为T AM R A修饰㊂簇毛麦基因组D N A探针采用缺口平移法,利用F l u o r e s-c e i n-12-d U T P进行标记㊂荧光原位杂交及顺序基因组原位杂交流程参照C h e n等[37]和Y a n g
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第9期郭江涛等:I n D e l分子标记W C656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5V S纯合易位中的应用
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等[38]的方法㊂利用O l y m p u sB X60型荧光显微镜观察染色体及杂交信号,使用S P O T C C D (S P O TC o o l e dC o l o rD i g i t a l)获得图像㊂1.2.4田间试验与成株期白粉病接种鉴定
田间试验在江苏省农业科学院院部基地进行,B C4F2分离群体于2019-2020年度粒播种植,行长1.75m,行距27c m,株距15c m;
B C4F2ʒ3家系和5V S易位系高代品系于2020~ 2021年度种植,每个家系50粒/行,行长1.6m,行距27c m㊂在被鉴定材料四周种植高感白粉病小麦品种苏麦3号作为诱发行,在每年2月初用感白粉病(用白粉病混合菌种感染)的幼苗种植于苏麦3号诱发行中,使苏麦3号发生白粉病,从而进一步诱发田间白粉病㊂当感病对照品种宁麦9号倒二叶上的白粉病严重度达到70%以上时进行白粉病调查,7d后进行第二次调查,白粉病抗性评价标准按0~4级分类[39],0~2级为抗病(R),3~4级为感病(S)㊂田间试验管理与大田生产一致㊂
1.2.5籽粒硬度测定
将收获晒干的小麦籽粒样品在同一条件下放置1个月后,利用P e r t e n4100型单籽粒谷物特性测试仪(S i n g l eK e r n e lC h a r a c t e r i z a t i o nS y s t e m, S K C S)测定籽粒硬度指数,单株材料检测50粒,高代品系检测300粒㊂
2结果与分析
2.1I n D e l分子标记W C656的开发
通过m I n D e l软件,开发小麦第5同源群短臂的I n D e l分子标记㊂基于普通小麦中国春参考基因组序列,针对5A㊁5B㊁5D基因组序列,利用滑动窗算法(s l i d i n g w i n d o w s)设计覆盖全部染色体的大规模探针池,进而针对第5同源群短臂,高通量预测染色体臂间的I n D e l变异,采用邻近I n-D e l聚合的策略,设计开发出高效㊁易检测的I n-D e l分子标记265个㊂进一步对265对第5同源群短臂的I n D e l标记引物预测扩增条带片段大小的分析,筛选出5A S㊁5B S㊁5D S片段小于600b p,不同片段大小之间差异较大(大于25b p)㊁易于琼脂糖凝胶电泳检测的65个标记,其中W C656的标记引物最大扩增片段为471b p(5B S条带), 5B S与5D S㊁5D S与5A S之间条带大小相差分别为49和43b p,易于区分5A S㊁5B S㊁5D S条带,因而利用该标记用于鉴别5V S纯合易位系㊂2.2小麦遗传材料的标记引物W C656分析2.2.1小麦-簇毛麦5V S易位系、小麦品种标记引物W C656分析
以普通小麦中国春,T5V S.5A L易位系z r q5V-2,T5V S.5D L易位系N A U415-2,以及长江中下游麦区育成和推广的21个小麦品种D N A 为模板,以W C656引物进行P C R扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测㊂结果表明,在T5V S. 5A L易位系z r q5V-2中扩增出471b p(5B S)和422b p(5D S)2条条带(图1a,泳道2),缺失379 b p(5A S)条带,说明z r q5V-2中5A S染色体臂已被代换㊂在T5V S.5D L易位系N A U415-2中扩增出379b p(5A S)和471b p(5B S)2条条带(图1a,泳道3),缺失422b p(5D S)条带,说明N A U415-2中5D S染色体臂已被代换㊂在中国春和21个小麦品种中均扩增出379b p(5A S)㊁471b p(5B S)422b p(5D S)3条条带(图1a,泳道4~ 24),说明这些材料第5同源群染色体短臂均没有被代换㊂因而,利用W C656引物进行检测,可以鉴别T5V S.5A L㊁T5V S.5D L等纯合易位系及其与其他普通小麦品种杂交而产生的纯合易位后代㊂2.2.2回交F2代分离群体中纯合易位单株的鉴定
以T5V S.5A L易位系z r q5V-2㊁T5V S.5D L 易位系N A U415-2为供体亲本,分别与宁麦9号㊁宁麦13杂交㊁回交,构建了回交4次的F2 (B C4F2)遗传群体,分别有94㊁180个单株,以这些单株D N A为模板,用W C656引物进行P C R 扩增㊁电泳检测,图1b和图1c所示部分单株的结果㊂图1b为z r q5V-2为供体亲本的B C4F2单株检测结果,单株B10-2㊁B10-4㊁B10-5㊁B10-11㊁B10-18㊁B10-19㊁B10-32(分别对应泳道1㊁4㊁5㊁9㊁11㊁18㊁19)的5A S条带缺失,表明这7个单株的5V S 代换了5A S,为T5V S.5A L纯合易位系单株㊂图1c为N A U415-2为供体亲本的B C4F2单株检测结果,单株B21-5㊁B21-25㊁B21-27㊁B21-58㊁B21-61㊁B21-65(分别对应泳道1㊁7㊁9㊁12㊁15㊁20)的5D S条带缺失,表明这6个单株的5V S代换了5D S,为T5V S.5D L纯合易位系单株㊂
2.35V S纯合易位的细胞学鉴定
利用寡核苷酸探针套,对通过标记W C656鉴别出的部分5V S纯合易位单株的染色体组成进行F I S H分析㊂图2b㊁图2e分别为T5V S. 5A L易位单株B10-2㊁T5V S.5D L易位单株B21-5的原位杂交结果,这2个单株(2n=6x=42)均
㊃8111㊃麦类作物学报第43卷
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含有一对易位染色体,在5V S 染色体臂端部具有
1对较强的红色信号,
近着丝粒区域有1对绿色信号㊂5A L 染色体近着丝粒区域有1对绿色信号㊁近中部有1对红色信号,5D L 上有3对红色信号,箭头分别所示5V S .5A L ㊁5V S .5D L 易位染色体㊂以簇毛麦基因组D N A 为探针进行顺序
G I S H ,
确认易位染色体的短臂来源于簇毛麦(图2c ㊁图2f
)㊂2.4 小麦-簇毛麦5V S 易位染色体单株的成株期白粉病抗性表现及遗传特点
对z r q 5V -2/4*
宁麦9号回交F 2群体分离单
株进行白粉病抗性鉴定,感白粉病单株为无5V S
单株,利用W C 656标记筛选的5V S .5A L 纯合易
位单株均抗白粉病(图2a ),表1所示F 2回交群
体中部分5V S 纯合易位单株㊁无易位单株的白粉病抗性表现㊂同样,宁麦13*4/N A U 415-2回交
F 2群体中,
感白粉病单株为无5V S 单株,标记引物W C 656筛选的5V S .5D L 纯合易位单株均抗
白粉病(表1)㊂对上述2个回交群体单株的F 2:3家系进行白粉病鉴定,5V S 纯合易位的F 2代单株,其F 2:3家系的所有单株均抗白粉病;无5V S 单株的家系所有单株均感白粉病,5V S 杂合易位的家系单株间表现为白粉病抗感分离㊂因而,在F 2回交分离群体中,
利用W C 656标记可以准确鉴别出抗白粉病的5V S 纯合易位单株㊂这两个群体中5V S 纯合易位单株㊁杂合易位单株㊁无5V S 单株的数目比例均符合1ʒ2ʒ1的分离比例( 20.05=5.99)(表2)
㊂ M :100b p D N Al a d d e r ;a :小麦品种(系)的W C 656检测结果;1:中国春;2:z r q
5V -2;3:N A U 415-2;4:宁麦9号;5:宁麦13;6:宁麦18;7:宁紫麦1号;8:扬麦13;9:扬麦15;10:扬麦16;11:扬麦20;12:扬麦25;13:扬麦29;14:扬辐麦4号;15:镇麦168;16:镇麦9号;17:镇麦10号;18:镇麦12;19:泰麦901;20:华麦1092;21:盐麦1号;22:农麦88;23:瑞华麦596;24:宁麦资166㊂b :B C 4F 2群体5
V S .5A L 纯合易位单株的标记引物W C 656检测结果;1~24:(z r q 5V -2/4*宁麦9号)B C 4F 2代单株,
1㊁4㊁5㊁9㊁11㊁18㊁19为纯合易位㊂c :B C 4F 2群体5V S .5D L 纯合易位单株的标记引物W C 656检测结果;1~24:(宁麦13*4/N A U 415-2)B C 4F 2代单株,
1㊁7㊁9㊁12㊁15㊁20为纯合易位㊂d :小麦-簇毛麦5V S 高代纯合易位系的标记引物W C 656检测结果;1:中国春;2~18:以T 5V S .5D L 为供体亲本的高代品系;
19~23:以T 5V S .5A L 为供体亲本的高代品系㊂
M :100b p D N Al a d d e r ;a :I d e n t i f i c a t i o no f d i f f e r e n tw h e a t c u l t i v a r s o r l i n e s b y W C 656m a r k e r ;1:C h i n e s e S p r i n g ;2:z r q
5V -2;3:N A U 415-2;4:N i n g m a i 9;5:N i n g m a i 13;6:N i n g m a i 18;7:N i n g z i m a i 1;8:Y a n g m a i 13;9:Y a n g m a i 15;10:Y a n g
m a i 16;11:Y a n g m a i 20;12:Y a n g m a i 25;13:Y a n g m a i 29;14:Y a n g
f u m a i 4;15:Z h e n m a i 168;16:Z h e n m a i 9;17:Z h e n m a i 10;18:Z h e n m a i 12;19:T a i m a i 901;20:H u a m a i 1092;21:Y a n m a i 1;22:N o n
g m a i 88;23:R u i
h u a m a
i 596;24:N i n g m a i z i 166.b :I d e n t i f i c a t i o no f 5V S .5A Lh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n i n d i v i d u a l s i nB C 4F 2g e n e t i c p o p u l a t i o n ;1-24:I n d i v i d u a l s o f z r q 5V -2/4*N i n g m a i 9F 2p
o p u l a t i o n ,1,4,5,9,11,18a n d 19a r e h o m o z y g o u s .c :I d e n t i f i c a t i o no f 5V S .5D Lh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n i n d i v i d u a l s i nB C 4F 2g e n e t i c p o p u l a -t i o n ;1-24:I n d i v i d u a l s o fN i n g m a i 13*4/N A U 415-2F 2p o p u l a t i o n ,1,7,9,12,15a n d20a r eh o m o z y g o u s .d :I d e n t i f i c a t i o no f 5V S h o m o z y g o u s a d v a n c e d t r a n s l o c a t i o n l i n e s ;1:C h i n e s eS p r i n g
;2-18:T 5V S .5D La d v a n c e d t r a n s l o c a t i o n l i n e s ;19-23:T 5V S .5A La d -v a n c e d t r a n s l o c a t i o n l i n e s .
图1 不同小麦遗传材料的W C 656标记引物P C R 扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果
F i g .1 A g a r o s e -g e l e l e c t r o p h o r e s i s o fP C R p r o d u c t s a m p l i f i e db y W C
656m a r k e r i nd i f f e r e n tm a t e r i a l s ㊃
9111㊃第9期
郭江涛等:I n D e l 分子标记W C 656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5V S 纯合易位中的应用Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
a㊁b㊁c分别为T5V S.5A L单株B10-2白粉病抗性鉴定㊁F I S H及G I S H检测图;d㊁e㊁f分别为T5V S.5D L单株B21-5白粉病抗性鉴定㊁F I S H及G I S H检测图㊂箭头示易位染色体,比例尺为10μm㊂
a,b,c:P o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c e a n d s e q u e n t i a l F I S Ha n dG I S Hi d e n t i f i c a t i o n o f T5V S.5A L s i n g l e p l a n t B10-2;d,e,f:P o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c ea n ds e q u e n t i a lF I S H a n dG I S Hi d e n t i f i c a t i o no fT5V S.5D Ls i n g l e p l a n tB21-5.A r r o w h e a d i n d i c a t e s t r a n s l o c a t i o n c h r o m o s o m e,s c a l eb a r=10μm.
图2T5V S.5A L(a,b,c)㊁T5V S.5D L(d,e,f)单株白粉病抗性鉴定及顺序F I S H-G I S H检测
F i g.2P o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c e a n d s e q u e n t i a l F I S Ha n d
G I S Hi d e n t i f i c a t i o no fT5V S.5A La n dT5V S.5D L i n d i v i d u a l s
2.5籽粒硬度分析
利用P e r t e n4100型单籽粒谷物特性测试仪(S K C S4100),对回交F2单株籽粒进行测定,回交群体受体亲本宁麦9号㊁宁麦13籽粒硬度指数分别为24.0ʃ0.8㊁58.2ʃ0.6㊂表1所示两个回交群体部分5V S纯合易位和无5V S易位F2单株籽粒的硬度指数,标记W C656鉴别出的5V S 纯合易位单株的籽粒硬度指数,显著低于无5V S 易位单株的硬度指数㊂对z r q5V-2/4*宁麦9号㊁宁麦13*4/N A U415-2所有F2代单株的籽粒硬度进行分析,5V S.5A L㊁5V S.5D L纯合易位单株的平均籽粒硬度指数分别为9.4㊁14.9,比无5V S 易位的单株分别降低59.3%㊁74.0%(表3)㊂2.6标记引物W C656在5V S易位系高代品系选育中的应用
以z r q5V-2㊁N A U415-2为供体亲本,与本地区宁麦9号㊁宁麦13㊁扬麦15㊁扬麦20等感白粉病弱筋小麦品种杂交㊁回交,在F2㊁F3等早代利用W C656筛选5V S纯合易位单株,后续世代对白粉病抗性㊁籽粒质地㊁农艺性状㊁产量等进行选择与鉴定,育成携有5V S染色体臂㊁抗白粉病的高代品系22个㊂以这些品系的D N A为模板,利用W C656引物进行P C R扩增,电泳检测结果所示(图1d),泳道1为中国春,扩增出379b p(5A S)㊁471b p(5B S)㊁422b p(5D S)3条条带㊂泳道(样品)2-18的5D S条带缺失,表明这17个品系的5V S代换了5D S,为T5V S.5D L纯合易位系㊂泳道(样品)19-23的5A S条带缺失,表明这5个品系的5V S代换了5A S,为T5V S.5A L纯合易位系㊂22个T5V S.5D L和T5V S.5A L易位系籽粒硬度指数在9.8~25.0之间,同样表现出较低的硬度指数㊂白粉病接种鉴定,新育成的5V S易位系高代品系均抗白粉病㊂
3讨论
普通小麦是由A㊁B㊁D3个染色体组组成的异源六倍体,染色体分带㊁基因组原位杂交(G I S H)㊁荧光原位杂交(F I S H)等细胞遗传学方法已广泛应用于普通小麦的起源与进化研究,也已用于普通小麦背景中簇毛麦染色体(臂)的鉴
㊃0211㊃麦类作物学报第43卷
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别
[11,28
]㊂与细胞遗传学方法相比,利用分子标记
方法鉴别染色体具有便捷㊁不受小麦生长发育条件限制等优点㊂鉴别普通小麦-簇毛麦5V S 易位系为供体亲本的分离世代植株的纯合易位类型,一是可以利用普通小麦5A S ㊁5B S ㊁5D S 与簇毛麦5V S 染色体臂共显性分子标记进行直接鉴别[29,33-35]
,二是可以利用普通小麦5A S ㊁5B S ㊁
5D S 共显性分子标记进行间接鉴别㊂
由于当前尚无小麦-簇毛麦5V S 易位系基因组信息,严重阻碍了5V S 与5A S ㊁5B S ㊁5D S 共显性分子标记的大规模开发和应用㊂同时,已开发的可以追踪5V S 的分子标记中,只有C I -N A U 211-700标记引物可以扩增出5
V S ㊁5A S ㊁5B S ㊁5D S 条带[3
4]
,但扩增产物需用聚丙烯酰胺凝表1 B C 4F 2群体部分5
V S 纯合易位和无5V S 易位单株的白粉病抗性及籽粒硬度指数T a b l e 1 P o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c e a n d g r a i nh a r d n e s s i n d e x o f 5V Sh o m o z y g
o u s t r a n s l o c a t i o na n d 5V Sn o n -t r a n s l o c a t i o n i nB C 4F 2p
a r t i a l i n d i v i d u a l s 株号
P l a n tN o .z r q 5V -2/4*宁麦9号F 2单株
I n d i v i d u a l o f z r q 5V -2/4*N i n g m a i 9F 2p
o p u l a t i o n 5V S .5A L 纯合易位
5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n
白粉病
P o w d e r y m i l d e w
硬度指数
H a r d n e s s i n d e x 株号
P l a n tN o .宁麦13*4/N A U 415-2F 2单株
I n d i v i d u a l o fN i n g m a i 13*4
/N A U 415-2F 2p o p u l a t i o n 5V S .5A L 纯合易位
5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n
白粉病
P o w d e r y m i l d e w
硬度指数
H a r d n e s s i n d e x B 10-2Y R 8.0
B 21-5
Y R 13.6B 10-4Y R 11.8B 21-12Y R 20.5B 10-5
Y R 7.9B 21-19Y R 19.2B 10-11Y R 8.9B 21-25Y R 13.5B 10-18Y R 9.2B 21-27Y R 19.4B 10-19Y R 6.8B 21-34Y R 13.2B 10-29Y R 5.5B 21-46Y R 19.6B 10-32Y R 9.0B 21-52Y R 11.7B 10-34Y R 9.4B 21-58Y R 15.8B 10-37Y R 9.1B 21-61Y R 18.7B 10-39Y R 8.6B 21-65Y R 18.0B 10-44Y R 6.6B 21-84Y R 16.6B 10-50Y R 13.9B 21-87Y R 22.8B 10-59Y R 11.8B 21-88Y R 10.5B 10-62Y R 7.8B 21-90Y R 15.0B 10-3N S 28.2B 21-3N S 49.7B 10-8N S 22.0B 21-4N S 50.7B 10-10N S 23.7B 21-7
N S 52.0B 10-20N S 22.3B 21-18N S 55.1B 10-21N S 21.2B 21-20N S 64.7B 10-23N S 23.1B 21-21N S 66.8B 10-26N S 19.4B 21-23N S 46.7B 10-35N S 26.2B 21-29N S 59.5B 10-46N S 23.0B 21-31N S 56.8B 10-51N S 21.7B 21-33N S 51.6B 10-52N S 23.5B 21-39N S 55.4B 10-72N S 26.9B 21-43N S 48.4B 10-73N S 20.6B 21-57N S 64.4B 10-78N S 28.9B 21-63N S 71.5B 10-87
N
S
22.5B 21-66N
S
57.8
Y 表示W C 656标记引物检测的5V S 纯合易位;N 表示无5V S 易位;R 表示抗白粉病;S 表示感白粉病㊂Y i n d i c a t e s 5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o nd e t e c t e db y m
a r k e rW C 656;Ni n d i c a t e s 5V Sn o n -t r a n s l o c a t i o n ;Ri n d i c a t e s r e s i s t a n c e t o p o w d e r y m i l d e w ;S i n d i c a t e s s u s c e p t i
b i l i t y t o p o w d e r y m
i l d e w.㊃
1211㊃第9期
郭江涛等:I n D e l 分子标记W C 656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5V S 纯合易位中的应用Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
表2B C4F2单株的W C656标记分析及白粉病抗性鉴定
T a b l e2W C656a n a l y s i s a n d i d e n t i f i c a t i o no f p o w d e r y m i l d e wr e s i s t a n c e i nB C4F2i n d i v i d u a l s
群体
G e n e t i c p o p u l a t i o n
总株数
I n v e s t i g a t e d
n u m b e r
5V S纯合易位
5V Sh o m o z y g o u s
t r a n s l o c a t i o n
5V S杂合易位
5V Sh e t e r o z y g o u s
t r a n s l o c a t i o n
无5V S易位
5V Sn o n-
t r a n s l o c a t i o n 2
z r q5V-2/4*宁麦9号
z r q5V-2/4*N i n g m a i9942346250.13
宁麦13*4/N A U415-2
N i n g m a i13*4/N A U415-218036103414.03
表3B C4F2不同易位类型单株的籽粒硬度指数
T a b l e3G r a i nh a r d n e s s i n d e x o f d i f f e r e n t t r a n s l o c a t i o n t y p e s i nB C4F2i n d i v i d u a l s
群体
G e n e t i c p o p u l a t i o n5V S纯合易位
5V Sh o m o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n5V S杂合易位
5V Sh e t e r o z y g o u s t r a n s l o c a t i o n无5V S易位
5V Sn o n-t r a n s l o c a t i o n z r q5V-2/4*宁麦9号
z r q5V-2/4*N i n g m a i99.4ʃ3.014.0ʃ2.123.1ʃ5.6
宁麦13*4/N A U415-2
N i n g m a i13*4/N A U415-214.9ʃ5.033.9ʃ6.157.3ʃ8.3
胶电泳检测,还没有可以经琼脂糖凝胶电泳检测㊁高效鉴别这4个染色体短臂的分子标记报道㊂I n D e l分子标记是基于基因组中插入/缺失位点
两侧的序列设计特异引物进行P C R扩增的标记,具有分布广㊁重复性好㊁开发成本低㊁结果准确等优点,已用于对基因型简单快速判别㊂本研究中的供体亲本为普通小麦-簇毛麦5V S.5A L㊁5V S. 5D L易位系,由于5V S染色体臂分别替换了普通小麦5A S㊁5D S染色体臂,因而利用普通小麦第5同源群染色体短臂的共显性I n D e l分子标记W C656进行检测,通过分析5A S㊁5D S电泳条带是否缺失,可以用来鉴别普通小麦-簇毛麦5V S. 5A L㊁5V S.5D L纯合易位㊂W C656扩增产物的电泳条带大小分别为379b p(5A S)㊁471b p (5B S)㊁422b p(5D S),5A S与5D S㊁5D S与5B S之间条带大小相差分别为43b p㊁49b p,通过琼脂糖凝胶电泳很容易将这3个条带区分开㊂顺序F I S H-G I S H分析结果与W C656鉴别的纯合易位一致㊂笔者以C I N A U211-700(5E S T-237)标记引物对5V S纯合易位进行分析,其结果也与W C656标记分析结果一致㊂
在减数分裂过程中,由于5V S与普通小麦5A S㊁5B S㊁5D S不配对,难以发生重组交换,因而位于5V S上的基因总是伴随5V S.5A L或5V S.5D L 易位染色体传递㊂本研究以分子标记W C656分别对z r q5V-2/4*宁麦9号㊁宁麦13*4/N A U415-2的回交F2分离群体检测,5V S纯合易位单株㊁5V S 杂合易位单株㊁无5V S易位单株的数量之比均符合1ʒ2ʒ1理论比值,表明5V S/5A L㊁5V S/5D L易位
染色体在普通小麦背景中能够正常遗传,同时5V S纯合易位单株表现抗白粉病和低籽粒硬度指数特性㊂由于簇毛麦5V S上携有抗白粉病基因P m55㊁籽粒硬度基因D i n a/D i n b等有益基因,因而可以将普通小麦-簇毛麦5V S.5A L和5V S. 5D L易位系以及I n D e l分子标记W C656,应用于软质弱筋小麦品种分子标记辅助选择的遗传改良研究㊂
4结论
利用普通小麦第5同源群染色体短臂共显性I n D e l分子标记W C656,P C R扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可以区分小麦5A S㊁5B S㊁5D S染色体臂,通过分析5A S㊁5D S电泳条带是否缺失,能够鉴别出以T5V S.5A L㊁T5V S.5D L易位系为供体亲本的杂交分离后代中的5V S纯合易位单株㊂参考文献:
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第9期郭江涛等:I n D e l分子标记W C656的开发及其在鉴别小麦-簇毛麦5V S纯合易位中的应用
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