曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法

曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于多酚氧化酶活性、过氧化物酶活
性、总酚含量和丙二醛含量的测定方法
1.多酚氧化酶（PPO）提取及活力测定
1.1基本原理：
多酚氧化酶（PPO）是一种以铜为辅基的酶，能催化多种简单酚类物质氧化形成醌类化合物，醌类化合物进一步聚合形成呈褐色、棕色或黑色的聚合物。

在后熟衰老过程或采后的贮藏加工过程中，果蔬出现褐变与组织中的多酚氧化酶活性密切相关。

多酚氧化酶催化邻苯二酚氧化物形成的产物在420nm处有最大光吸收峰。

因此，可以用比色法测定多酚氧化酶的活性。

1.2实验试剂和仪器：
a.仪器及用具：研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（100mL、1000mL）
b．试剂
1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液
母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）
称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3）50mmol/L邻苯二酚溶液
取275mg邻苯二酚，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至50mL。

1.3实验步骤
1）酶液制备
称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

2）活性测定
取一支试管，加入4.0mL 50mmol/L、pH5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液（2.0mL 0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液加蒸馏水稀释4.0mL）和1.0mL 50mmol/L邻苯二酚溶液，最后加入100μL 酶提取液，同时立即开始计时。

将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。

以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长420nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。

重复三次。

1.4数据处理：
记录反应体系在420nm处的吸光值，制作OD420值随时间变化曲线，根据曲线的初始线
性部分（从时间I到时间F）计算每分钟吸光度值变化ΔOD420。

ΔOD420=OD420F−OD420I
t F−t I
式中ΔOD420——每分钟反应混合液吸光度变化值；
OD420F——反应混合液吸光度终止值；
OD420I——反应混合液吸光度初始值；
t F——反应终止时间，min；
t I——反应初始时间，min。

以每克果蔬样品（鲜重）每分钟吸光度变化值增加1为1个活性单位，单位是ΔOD420/min·g。

计算公式：
U=ΔOD420×V
V s×m
式中V——样品提取液总体积，mL；
V S——测定时所取样品提取液体积，mL；
m——样品质量，g。

2.过氧化物酶（POD）提取及活力测定
2.1实验试剂和仪器
a．仪器及用具
研钵、高速冷冻离心机、分光光度仪、计时器、移液器、离心管、试管、容量瓶（50mL、100mL 、1000mL）。

b．试剂
1）0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液
母液A（200mmol/L醋酸溶液）：量取11.55mL冰醋酸，加蒸馏水稀释至1000mL。

母液B（200mmol/L醋酸钠溶液）：称取16.4g无水醋酸钠（或称取27.2g三水合乙酸钠），用蒸馏水溶解、定容至1000mL。

取68mL母液A和432mL母液B混合后，调节pH至5.5，加蒸馏水稀释至1000mL。

2）提取缓冲液（含1mmol PEG、4% PVPP和1% Triton X-100）
称取340mg PEG 6000（聚乙二醇6000）、4%PVPP（聚乙烯吡咯烷酮，polyvinyl-polypyrrolidone），取1mL Triton X-100，用0.1mol/L、pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液溶解、稀释至100mL。

3）25mmol/L愈创木酚溶液
取320μL愈创木酚，用50mmol/L、pH5.5乙酸缓冲液稀释至100mL。

4）0.5mol/L H2O2溶液
取1.42mL 30% H2O2溶液（30% H2O2溶液的浓度约为17.6mol/L），用50mmol/L、pH5.5乙酸缓冲液稀释至50mL，现用现配，避光保存。

2.2实验步骤
1）酶液制备
称取5.0g果蔬组织样品，置于研钵中，加入5.0mL提取缓冲液，在冰浴条件下研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液即为酶提取液，低温保存备用。

2）活性测定
取一支试管，加入3.0mL 25mmol/L（1.5mL 0.5mol/L H2O2溶液加蒸馏水稀释至3.0mL）愈创木酚溶液和0.5mL酶提取液，再加入200μL 0.5mol/L H2O2溶液迅速混合启动反应，同时立即开始计时。

将反应混合液倒入比色杯中，置于分光光度计样品室中。

以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在波长470nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔1min记录一次，连续测定，至少获取6个点的数据。

重复三次。

3.总酚含量测定
参照曹建康《果蔬采后生理生化实验指导》中关于总酚的测定，单位：mg/100g。

此方法仅能判断测定样品之间总酚、类黄酮和花青素的相对含量。

如果需要测定准确含量，需要与标准曲线进行比较。

可以用不同浓度的没食子酸制作标准曲线，计算总酚物质含量，用μmol/g m F表示。

1.仪器及用具
研钵、具塞刻度试管（20mL）、滤纸、漏斗、移液器、紫外可见分光光度计。

2.试剂
1%（体积分数）盐酸-甲醇溶液。

取0.1mL浓盐酸（分析纯），加入到99mL甲醇中，摇匀，于4℃预冷。

3.实验步骤
1）提取
称取2.0g果肉组织，加入少许经预冷的1% HCl-甲醇溶液，在冰浴条件下研磨均匀后，转入20mL刻度试管中。

用1% HCl-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试管中，定容至刻度，混匀，于4℃避光提取20min，期间摇动数次，然后过滤，收集滤液待用。

2）测定
以1% HCl-甲醇溶液作为空白参比调零，取滤液分别于波长280nm、325nm、600nm和530nm 处测定溶液的吸光度值，重复三次。

实验结果与计算
4.丙二醛（MDA）测定
4.1实验基本原理
果蔬组织在后熟衰老过程中，遭受病害、冷害或其他伤害等逆境胁迫时，细胞中产生的超氧阴离子自由基和羟基自由基，能诱导膜脂中不饱和脂肪酸发生过氧化作用，产生脂质自由基。

脂质自由基可以进一步诱导膜脂的过氧化作用，导致细胞膜透性增加，细胞受到损伤或死亡。

丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用的主要产物之一，通常利用它的含量作为脂质过氧化指标，反应膜脂过氧化程度反应细胞膜脂过氧化程度，并且含量越高，表明果蔬越衰老加剧。

丙二醛可以与蛋白质、核酸反应，改变这些大分子的构型，或使之产生交联反应，从而丧失生物功能。

MDA还可以使纤维素分子间的桥键松弛，或抑制蛋白质的合成。

因此，MDA的积累能对果蔬细胞质膜和细胞器造成一定的伤害。

根据相关反应原理，用下列公式消除由蔗糖引起的误差，
c(μmol/L)=6.45×（OD532-OD600）-0.56×OD450
式中OD450、OD532、OD600——分别代表450nm、532nm、600nm波长处的吸光度值。

运用上式可直接求得果蔬组织提取液中的MDA浓度，从而进一步计算出果蔬组织中MDA 的含量。

4.2实验试剂和仪器
a．仪器及用具
研钵、试管、移液器、恒温水浴锅、离心机、分光光度计、电子天平、离心管。

b．试剂
1）100g/L三氯乙酸（TCA）溶液
取10g三氯乙酸，用蒸馏水溶解、稀释至100mL。

2）6.7g/L硫代巴比妥酸（TBA）溶液
称取0.67g硫代巴比妥酸，用100mL 0.05mol/L NaOH溶液溶解。

4.3实验步骤
1）称取1.0g果蔬样品，加入5.0mL 100g/L TCA溶液，研磨匀浆后，于4℃、10000×g离心20min，收集上清液，低温保存备用。

2）取2.0mL上清液（对照空白管中加入2.0mL 100g/L TCA溶液代替提取液），加入2.0mL 0.67% TBA，混合后在沸水浴中煮沸20min，取出冷却后再离心一次。

分别测定上清液在450nm、532nm和600nm波长处的吸光度值。

重复三次。

4.4数据处理
根据溶液的吸光度值，按照前面的公式计算出反应混合液中丙二醛含量，再按照下式计算出每克果蔬样品（鲜重）中丙二醛的含量，以μmol/g m F表示。

计算公式：
（μmol/g m F）
丙二醛含量=c×V
V S×m×1000
式中c——反应混合液中丙二醛浓度，μmol/L；
V——样品提取液总体积，mL；
V S——测定时所取样品提取液体积，mL；
m——样品质量，g。